Protocol for Citrus Anther Culture   

材料与试剂

1. 自封袋
   
2. 锡箔纸
   
3. 载玻片
4. 盖玻片
5. 滤纸
6. 吸水纸
7. 柑橘花蕾
   
8. 冰盒
   
9. 醋酸洋红 
10. NAA (4 °C保存)
    
11. 活性炭
    
12. 1 mol/L HCl
    
13. 50% NaClO
    
14. 无菌水
15. 培养基 (详见柑橘组培常用培养基配制方法 [杨雯惠等，2018])
    1)

    MT培养基
    

    2)

    生芽 (SY) 培养基
    

    3)

    1/2 MT培养基
16. 1%醋酸洋红 (见溶液配方)
    
17. 花药诱导培养基 (见溶液配方) 

仪器设备

1. 镊子
   
2. 普通显微镜
   
3. 大镊子
   
4. 手术刀
   
5. 三角瓶
   
6. 4 °C冰箱
   
7. pH计
   
8. 灭菌锅
   
9. 超净工作台

实验步骤

1. 材料选择
   1.1

   小孢子发育时期：选取小孢子处于单核靠边期的花蕾进行培养。原因是处于单核靠边期的小孢子是由杂合母细胞减数分裂形成独立细胞的一个时期 (四分体时期之后)，营养积累充足，达到了花药培养的遗传和营养的条件。
   

   1.2

   采样、预处理及检测

   1)

   于4月晴天上午采集柑橘花蕾，放于自封袋，用锡箔纸包住，置于冰盒中。根据经验，处于单核靠边期的柑橘花蕾一般有花萼处于花瓣二分之一处的形态特征，此时的花蕾正处于由淡绿色向淡黄色的转变时期。
   注：采样时期依据不同物种而定，一般柑橘花蕾期为4月初。
   

   2)

   花采回后置于4 °C下暗处理3-5天，若工作量比较大，可延长至7天，但是时间不宜太长。因为冷处理是一种低温胁迫，促进花药中的小孢子发育成个体，但是4 °C下的小孢子仍处于慢慢生长状态，预处理时间太长，小孢子会出现向成熟花粉发育的趋势，不利于花药培养。

   3)

   醋酸洋红检验小孢子发育时期

   a)

   用镊子夹下3-4个花药放于载玻片中央，加1-2滴1%醋酸洋红，用镊子的尖端轻轻敲打，使花药破碎，并将花药碎片夹出。
   

   b)

   盖上盖玻片，盖时用镊子夹住盖玻片一角，使之倾斜与载玻片呈30-45°，缓慢放下盖玻片，防止气泡产生，并用滤纸吸干多余的醋酸洋红。
   

   c)

   在显微镜20或40倍镜下观察小孢子发育时期，若大部分小孢子处于单核靠边期，说明此时的花药比较适合，则选择此花蕾形态的花药进行培养。
2. 花蕾消毒及花药接种 (超净工作台)
   2.1

   取花蕾置于无菌的三角瓶中，加入1 mol/L的HCl, 浸没花蕾，轻轻摇晃30 sec。然后将HCl倒出，加入50%的NaClO，同样浸没花蕾，10 min后倒出，期间要多次轻轻摇晃。再加入无菌水，清洗3-5次，每次3-5 min。
   注：

   1)

   加入HCl时，避免接触到手，因有强烈的腐蚀性，三角瓶放在台面上时，可以在底部垫一些吸水纸。
   

   2)

   换溶液时，应缓慢倾斜倒出，防止花蕾也被倒掉。
   

   3)

   HCl和NaClO不能混合，否则会产生毒气体氯气。
   

   4)

   加入NaClO后，浸泡10 min期间，换无菌三角瓶，防止污染。
   

   5)

   每换一次无菌水，换一个无菌的三角瓶。

   2.2

   取2-3朵花蕾置于铺有滤纸的玻璃皿上 (无菌)，用镊子拨开，确定其花药与花丝连接处的位置 (一般为整朵花的1/3-1/2处)，一刀切下。此时，既要保证花丝全部切掉 (吸收花药营养，影响小孢子生长)，又要保证花药不能受到伤害 (受伤后培养过程中很易褐化)。用镊子将花药均匀撒于培养基表面，使花药最大面积的接触到培养基，即花药横卧于培养基表面，且尽量使花药凹面接触于培养基 (凹面易散发小孢子)。
   注：

   1)

   若花丝未切掉，则需再将其切掉。
   

   2)

   每个培养基花药不宜放太多，因品种而定，一般2-3朵花蕾。
3. 25 °C暗培养，三个月左右即可观察有无愈伤或者胚状体出现。也可暗培养一段时间后置于光培下诱导。
   
4. 长出愈伤或胚状体后，将愈伤继代至普通MT上，胚状体继代到SY培养基上，扩繁并诱导生根。
   
5. 倍性鉴定
   5.1

   愈伤或者胚状体的流式细胞仪测定 (详见流式细胞仪倍性鉴定法 [袁东亚等，2018])。
   

   5.2

   染色体涂片制片法 (详见柑橘染色体涂片制片法 [王蓉等，2018])。

溶液配方

1. 1%醋酸洋红
   洋红1 g，45%醋酸100 ml，煮沸2 h左右，并不断补充蒸馏水，保证其总体积不变，之后冷却过滤，加入4%铁明矾 (硫酸铁铵) 溶液1-2滴 (不能加多，否则会发生沉淀)，放入棕色瓶中常温保存备用
   
2. 花药诱导培养基 (1 L)
   
   

参考文献

1. 王蓉，苗茵，兰红，陈春丽，郭文武. (2018). 柑橘染色体涂片制片法. Bio-101 e1010191. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010191.
   
2. 袁东亚，解凯东，王惠芹，郭文武. (2018). 柑橘流式细胞仪倍性鉴定. Bio-101 e1010192. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010192.
   
3. 杨雯惠，解凯东，郭文武. (2018). 柑橘组织培养常用培养基配制方法. Bio-101 e1010184. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010184. 
   
4. Wang, S. M., Lan, H., Cao, H. B., Xu, Q., Chen, C. L., Deng, X. X. and Guo, W. W. (2015) Recovery and characterization of homozygous lines from two sweet orange cultivars via anther culture. Plant Cell Tiss Organ Cult 123(3): 633-644.