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柑橘染色体涂片制片法   

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实验原理及目的:植物涂片法指将植物材料酶解去掉细胞壁后,经低渗液处理,用针尖敲碎后在玻片上平铺展开,火焰干燥使染色体膨胀,得到分散良好、背景干净的染色体和细胞核,又称低渗火焰干燥法。涂片制片法在植物细胞生物学、细胞遗传学、分子细胞生物学等研究中应用广泛,主要进行染色体计数、核型分析、荧光原位杂交等相关实验。

关键词: 涂片, 染色体, 细胞学

材料与试剂


  1. 吸水纸
  2. 培养皿
  3. 滤纸
  4. 纱布
  5. 2 ml离心管
  6. 吸管
  7. 载玻片
  8. 柑橘果实
  9. 饱和对二氯苯 (RT) 
  10. 0.075 mol/L KCl (RT) 
  11. 乙醇
  12. 乙酸
  13. 柠檬酸
  14. 二水合柠檬酸三钠
  15. ddH2O
  16. Pectinase (Aspergillus niger, Sigma-Aldrich, 4 °C) 
  17. Cellulose (“Onozuka”RS, Yakult Pharmaceutical Industry, 4 °C) 
  18. Pectolgase (Y-23, Yakult Pharmaceutical Industry, 4 °C) 
  19. 10x EB (柠檬酸钠缓冲液) (见溶液配方) 
  20. 酶混合液 (见溶液配方)

仪器设备


  1. 镊子
  2. 手术刀
  3. 打火机
  4. 大头针
  5. 28 °C培养箱
  6. 水浴锅
  7. -20 °C冰箱
  8. 摇床
  9. 解剖镜
  10. 移液器
  11. 相差显微镜 (Olympus, model: BH-2)

实验步骤

  1. 取材和前处理
    1.1
    用刀将柑橘果实小心切开,取出种子,放入装有清水的盆中浸泡30-60 min,浸泡过程中搓洗种子2-3次,再平铺于吸水纸上晾干。
    注:因柑橘种子外表皮果胶较多,为方便剥掉种皮,需用清水搓洗,种子浸泡时间视果胶多少而定。
    1.2
    在培养皿中平铺两张滤纸,用清水浸湿,上面盖上2-3层纱布,再用清水浸湿。种子剥掉内外种皮,均匀摆放在纱布上,加清水至半浸没种子。28 °C避光培养7-10 d (视根尖生长情况而定),期间不间断观察,水干后及时续加。
    注:
    1) 种子摆放于纱布上时,不宜太过密集,不利于萌发,应保持2-3 cm的间距。待初生根生长到1 cm左右时,解剖刀切取根尖前端3-5 mm,用镊子放入装有蒸馏水的2 ml离心管中,置于冰上。
    2) 当根尖生长短于1 cm时,分生组织活动最为旺盛,易于得到正在分裂的染色体。
    3) 取根尖时,至少小于5 mm,切口更接近于分生区,利于溶液的吸收。
    4) 根尖最好置于底部较平的2 ml离心管中,利于吸收试剂,每个离心管中根尖条数不能多于15条。
    1.3
    取完根尖后,吸管轻轻吸出水,再加入饱和对二氯苯溶液,20 °C水浴3 h。吸出饱和对二氯苯溶液,加入0.075 mol/L KCl室温处理30 min,再换新制卡诺固定液 (乙醇:乙酸 = 3:1) 常温固定24 h。固定后用70%乙醇4 °C保存备用,长期储存在-20 °C。
    注:对根尖进行预处理时,会经常更换试剂,因根尖较小,容易吸出,需小心谨慎。对二氯苯对细胞代谢活动的毒害是较大的,预处理液的温度过高或处理时间过长,很容易导致产生染色体断裂、黏连等类似辐射畸变的效应。
  2. 酶解根尖
    2.1
    用镊子将固定好的根尖取出放入柠檬酸钠缓冲液中,置摇床上中低速摇3-5次,5 min/次,每次均需换柠檬酸钠缓冲液。
    注:因从卡诺固定液中取出的根尖吸取了大量的乙醇,为保证酶解充分,需用柠檬酸钠缓冲液清洗至少3次。
    2.2
    解剖镜下切除根尖至2-3 mm,滤纸吸干根尖水分,用镊子轻轻放入装有酶混 合液的2 ml离心管中,每管最多有4条根尖,酶液40-60 µl。37 °C水浴90 min左右,根尖上部处于透明弥散状态即表明已酶解好。
    注:根尖水分尽量吸干,酶液中放入根尖时,不要用镊子搅动,以免浪费酶 液。根尖放入酶液后,确保没有粘在管壁上,确保酶解充分。
  3. 涂片制片
    3.1
    在酶解好的根尖中缓慢加入柠檬酸钠缓冲液或ddH2O稀释,终止酶解。
    注:酶解后的根尖已经软化,极易破碎,所以不能剧烈晃动。
    3.2
    用吸管慢慢将根尖移到预先晾干的干净载玻片中间区域,在解剖镜下仔细地用大头针解剖根尖,去掉杂质和不能解开的材料块,留下乳白色区域。
    3.3
    用吸管和干净的滤纸吸走多余的水份和杂质,大头针垂直轻轻敲打根尖至匀浆状。在根尖周围用移液枪滴加约10 µl新配制的60%乙酸,大头针再轻轻敲打至混匀。移液枪悬空滴加1~2滴约15 µl (视根尖大小而定) 新配置的卡诺固定液 (乙醇:乙酸=3:1) 展片,用打火机立刻点燃固定液,待固定液干燥后即完成制片。一般来说火焰燃烧能够最大程度的将分裂相展开。用相差显微镜20倍下检测,选择染色体分裂相好且多,杂质较少的染色体片,-20 °C保存备用。
    注:
    1)
    用吸管和滤纸吸走水分时,不能完全吸干,要保留一点水分,便于后续展片。 
    2)
    大头针敲打根尖时,也可看出是否酶解充分,若一敲即化,无碎渣,则表示已经酶解好。
    3)
    60%乙酸和卡诺固定液需放在冰上,悬空滴加卡诺固定液时,不宜太高,防止细胞过于分散。

溶液配方

  1. 10x EB (柠檬酸钠缓冲液) 

  2. 酶混合液
    2.1
    母液

    2.2
    工作液

参考文献

  1. 苗茵, 徐凤娇, 兰红, 陈春丽. (2014). 沙田柚实生苗染色体的荧光显带分析. 华中农业大学学报 33(01): 18-23.
  2. Lan, H., Chen, C. L., Miao, Y., Yu, C. X., Guo, W. W., Xu, Q. and Deng, X. X. (2016). Fragile Sites of 'Valencia' Sweet Orange (Citrus sinensis) Chromosomes Are Related with Active 45s rDNA. PLoS One 11(3): e0151512.
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王蓉, 郭文武. (2018). 柑橘染色体涂片制片法. Bio-101: e1010191. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010191.
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