柑橘组织培养常用培养基配制方法   

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Original research article

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Rice Protocol e-book

关键词: 柑橘, 组培, 培养基

材料与试剂

  1. 活性炭
  2. KNO3
  3. NH4NO3
  4. KH2PO4
  5. MgSO4·7H2O
  6. CaCl2·2H2O
  7. KI
  8. H3BO3
  9. ZnSO4·7H2O
  10. NaMoO4·2H2O
  11. CuSO4·5H2O
  12. CoCl2·H2O
  13. MnSO4·4H2O
  14. VB1 (盐酸硫氨素) (Genview, catalog number: HV365)
  15. VB6 (盐酸吡哆素) (Genview, catalog number: HV368)
  16. VB5 (烟酸) (Genview, catalog number: HV364)
  17. VB
  18. VC (北京鼎国昌盛生物技术有限公司)
  19. 肌醇 (北京鼎国昌盛生物技术有限公司)
  20. 微量
  21. 铁盐
  22. 甘氨酸 (国药集团有限公司,catalog number: 62011519)
  23. 大量元素
  24. 蔗糖
  25. 琼脂
  26. 麦芽提取物
  27. L-谷氨酰胺
  28. BA (Genview)
  29. KT
  30. NAA (Genview, catalog number: IN211)
  31. IAA
  32. GA3 (Genview, catalog number: AG140)
  33. IBA (Genview, catalog number: II172)
  34. 蛋白胨
  35. 酵母提取物
  36. 氯化钠
  37. 水解络蛋白

仪器设备

  1. 量筒
  2. 烧杯
  3. 玻璃棒
  4. 棕色细口瓶
  5. 5 L存储瓶
  6. 天平
  7. 4 °C冰箱

实验步骤

一、培养基母液的配制

  1. 大量元素 (10倍液):称取下列药品分别溶解定容到1 L后,加到5 L存储瓶中。
    KNO3
    95 g
    NH4NO3
    82.5 g
    KH2PO4
    8.5 g
    MgSO4·7H2O
    18.5 g
    CaCl2·2H2O
    22.0 g
    注:
    1)
    配置母液前要仔细清洗存储容器。
    2)
    应按照顺序分别彻底溶解后混合,每加完一种药品,摇动存储瓶使其混合均匀。
    3)
    溶解时最好加热,以便充分溶解,避免沉淀的产生。
    4)
    夏季要用新制的蒸馏水,并加热,这样可以避免因为水中带菌量过大而产生沉淀,同时可以减缓绿藻的生成。
    5)
    沉淀的产生一是由于溶解不充分就混合造成的 (浑浊型沉淀),所以配置时一定不要急;二是由于长菌而产生絮状沉淀,所以要用新制的蒸馏水并加热。
  2. 微量元素母液的配制 (100倍):取少量 (200-300 ml) 温水依次加入下列药品,每加一种药品后搅拌溶解,最后定容到1 L。
    KI
    0.083 g
    H3BO3
    0.62 g
    ZnSO4·7H2O
    0.86 g
    NaMoO4·2H2O
    0.025 g
    CuSO4·5H2O
    0.0025 g
    CoCl2·6H2O
    0.0025 g
    MnSO4·4H2O
    2.23 g (MnSO4·H2O 1.69 g)
    注:
    1)
    配好后在室温下放置10 h以上再放入冰箱保存,即刻放入冰箱易产生结晶沉淀。
    2)
    配制过程中产生沉淀的原因有:前一个没彻底溶解就加入了后一个药品;蒸馏水pH值过高,可加几滴盐酸校正。
  3. 甘氨酸和肌醇的配制 (100倍):甘氨酸0.2 g溶解定容到1 L,肌醇10 g溶解定容到1 L。
  4. 铁盐的配制 (100倍):称取EDTA 3.73 g,FeSO4·7H2O 2.78 g,分别溶解后混合定容到1 L,放入棕色细口瓶中,室温放置10 h以上 (防止结晶沉淀),然后放入4 °C冰箱。
  5. 维生素B的配制 (100倍)
    MT:
    VB1 (盐酸硫氨素)
    1 g
    MS:
    10 mg

    VB6 (盐酸吡哆素)
    1 g

    50 mg

    VB5 (烟酸)
    0.5 g

    50 mg
    分别按顺序称取溶解在温热的蒸馏水中,定容到1 L。
    注:需要溶解完一个再加另一个,VB5不易溶解,需要搅拌,必要时可以加热。
  6. VC的配制:称取VC 0.5 g 溶解在蒸馏水中,定容到1 L即可。
  7. 其他:BA,NAA,IBA,GA3等激素类试剂可先用少量1 M NaOH彻底溶解,再加水定容。配好后在室温放置一段时间,再放入4 ℃冰箱中冷藏保存。有些试剂在乙醇或盐酸中也可溶解,但比较而言,用碱溶解比较稳定,不易产生沉淀。
    注:母液最好不要配制太多,如果配制的量较大,短时间内用不完,最好分装一部分到小的细口瓶中,在做培养基时使用。这样不容易产生沉淀。

二、各种培养基配方

  1. MT基本培养基 (1 L)
    VB 10 ml
    VC
    10 ml
    肌醇
    10 ml
    微量
    10 ml
    铁盐
    10 ml
    甘氨酸
    10 ml
    大量元素
    100 ml
    蔗糖
    40 g
    琼脂
    8 g
  2. MT悬浮培养基 (1 L)
    VB 10 ml
    VC
    10 ml
    肌醇
    10 ml
    微量
    10 ml
    铁盐
    10 ml
    甘氨酸
    10 ml
    大量元素
    100 ml
    蔗糖
    40 g
    麦芽提取物 0.5 g
    L-谷氨酰胺 1.5 g
  3. MT播种培养基 (1 L)
    VB 10 ml
    VC
    10 ml
    肌醇
    10 ml
    微量
    10 ml
    铁盐
    10 ml
    甘氨酸
    10 ml
    大量元素
    100 ml
    蔗糖
    25 g
    琼脂
    8 g
  4. 生芽培养基 (1 L)
    VB 10 ml
    VC
    10 ml
    肌醇
    10 ml
    微量
    10 ml
    铁盐
    10 ml
    甘氨酸
    10 ml
    大量元素
    100 ml
    蔗糖
    40 g
    BA 0.5 mg
    KT 0.5 mg
    NAA 0.1 mg
    琼脂
    8 g
  5. 伸长培养基 (1 L)
    VB 10 ml
    VC
    10 ml
    肌醇
    10 ml
    微量
    10 ml
    铁盐
    10 ml
    甘氨酸
    10 ml
    大量元素
    100 ml
    蔗糖
    40 g
    BA 0.1 mg
    IAA 0.5 mg
    GA3 0.5 mg
    琼脂
    8 g
  6. 生根培养基 (1 L)
    VB 10 ml
    VC
    10 ml
    肌醇
    10 ml
    微量
    10 ml
    铁盐
    10 ml
    甘氨酸
    10 ml
    大量元素
    50 ml
    蔗糖
    25 g
    IBA 0.1 mg
    NAA 0.5 mg
    活性炭 0.5 g
    琼脂
    8 g
    注:以上培养基PH应调到5.8-6.0之间,配好分装灭菌后使用,各类激素可配成母液按照相对应的量吸取加入即可。
  7. 液体LB培养基 (1 L)
    蛋白胨
    10 g
    酵母提取物
    5 g
    氯化钠 10 g
  8. 固体LB培养基 (1 L)
    蛋白胨
    10 g
    酵母提取物
    5 g
    氯化钠 10 g
    琼脂
    15 g
    注:固体液体培养基均不需要调pH,配好分装灭菌后使用。
  9. YEB培养基 (1 L)
    蛋白胨
    1 g
    酵母提取物
    5 g
    水解络蛋白
    5 g
    七水硫酸镁
    0.493 g
    琼脂
    15-20 g
    注:YEB培养基pH为7.0,可不调pH。
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:杨雯惠, 解凯东, 郭文武. (2018). 柑橘组织培养常用培养基配制方法. Bio-101: e1010184. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010184.
How to cite: Yang, W. H., Xie, K. D. and Guo, W. W. (2018). Medium Preparation for Citrus Tissue Culture. Bio-101: e1010184. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010184.
Q&A

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