Medium Preparation for Citrus Tissue Culture ^Updated   

材料与试剂

1. 活性炭
   
2. KNO₃
3. NH₄NO₃
   
4. KH₂PO₄
   
5. MgSO₄·7H₂O
   
6. CaCl₂·2H₂O
   
7. KI
   
8. H₃BO₃
   
9. ZnSO₄·7H₂O
   
10. NaMoO₄·2H₂O
    
11. CuSO₄·5H₂O
    
12. CoCl₂·H₂O
    
13. MnSO₄·4H₂O
    
14. VB₁ (盐酸硫氨素) (Genview, catalog number: HV365)
    
15. VB₆ (盐酸吡哆素) (Genview, catalog number: HV368)
    
16. VB3 (烟酸) (Genview, catalog number: HV364)
    
17. VB
    
18. VC (北京鼎国昌盛生物技术有限公司)
    
19. 肌醇 (北京鼎国昌盛生物技术有限公司)
    
20. 微量
    
21. 铁盐
    
22. 甘氨酸 (国药集团有限公司，catalog number: 62011519)
    
23. 大量元素
    
24. 蔗糖
    
25. 琼脂
    
26. 麦芽提取物
    
27. L-谷氨酰胺
    
28. BA (Genview)
    
29. KT
    
30. NAA (Genview, catalog number: IN211)
    
31. IAA
    
32. GA₃ (Genview, catalog number: AG140)
    
33. IBA (Genview, catalog number: II172)
    
34. 蛋白胨
    
35. 酵母提取物
    
36. 氯化钠
37. 水解络蛋白
    

仪器设备

1. 量筒
   
2. 烧杯
   
3. 玻璃棒
   
4. 棕色细口瓶
   
5. 5 L存储瓶
   
6. 天平
   
7. 4 °C冰箱

实验步骤

一、培养基母液的配制

1. 大量元素 (10倍液)：称取下列药品分别溶解定容到1 L后，加到5 L存储瓶中。
   

   KNO3	95 g
   NH4NO3	82.5 g
   KH2PO4	8.5 g
   MgSO4·7H2O	18.5 g
   CaCl2·2H2O	22.0 g

   注：
   1)

   配置母液前要仔细清洗存储容器。
   

   2)

   应按照顺序分别彻底溶解后混合，每加完一种药品，摇动存储瓶使其混合均匀。
   

   3)

   溶解时最好加热，以便充分溶解，避免沉淀的产生。
   

   4)

   夏季要用新制的蒸馏水，并加热，这样可以避免因为水中带菌量过大而产生沉淀，同时可以减缓绿藻的生成。
   

   5)

   沉淀的产生一是由于溶解不充分就混合造成的 (浑浊型沉淀)，所以配置时一定不要急；二是由于长菌而产生絮状沉淀，所以要用新制的蒸馏水并加热。
2. 微量元素母液的配制 (100倍)：取少量 (200-300 ml) 温水依次加入下列药品，每加一种药品后搅拌溶解，最后定容到1 L。
   

   KI	0.083 g
   H3BO3	0.62 g
   ZnSO4·7H2O	0.86 g
   NaMoO4·2H2O	0.025 g
   CuSO4·5H2O	0.0025 g
   CoCl2·6H2O	0.0025 g
   MnSO4·4H2O	2.23 g (MnSO4·H2O 1.69 g)

   注：
   1)

   配好后在室温下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易产生结晶沉淀。
   

   2)

   配制过程中产生沉淀的原因有：前一个没彻底溶解就加入了后一个药品；蒸馏水pH值过高，可加几滴盐酸校正。
3. 甘氨酸和肌醇的配制 (100倍)：甘氨酸0.2 g溶解定容到1 L，肌醇10 g溶解定容到1 L。
   
4. 铁盐的配制 (100倍)：称取EDTA 3.73 g，FeSO₄·7H₂O 2.78 g，分别溶解后混合定容到1 L，放入棕色细口瓶中，室温放置10 h以上 (防止结晶沉淀)，然后放入4 °C冰箱。
   
5. 维生素B的配制 (100倍)
   

   MT：	VB1 (盐酸硫氨素)	1 g	MS：	10 mg
   	VB6 (盐酸吡哆素)	1 g		50 mg
   	VB3 (烟酸)	0.5 g		50 mg

   分别按顺序称取溶解在温热的蒸馏水中，定容到1 L。
   注：需要溶解完一个再加另一个，VB₃不易溶解，需要搅拌，必要时可以加热。
   
6. VC的配制：称取VC 0.5 g 溶解在蒸馏水中，定容到1 L即可。
   
7. 其他：BA，NAA，IBA，GA₃等激素类试剂可先用少量1 M NaOH彻底溶解，再加水定容。配好后在室温放置一段时间，再放入4 ℃冰箱中冷藏保存。有些试剂在乙醇或盐酸中也可溶解，但比较而言，用碱溶解比较稳定，不易产生沉淀。
   注：母液最好不要配制太多，如果配制的量较大，短时间内用不完，最好分装一部分到小的细口瓶中，在做培养基时使用。这样不容易产生沉淀。
   
   

二、各种培养基配方

1. MT基本培养基 (1 L)

   VB	10 ml
   VC	10 ml
   肌醇	10 ml
   微量	10 ml
   铁盐	10 ml
   甘氨酸	10 ml
   大量元素	100 ml
   蔗糖	40 g
   琼脂	8 g

2. MT悬浮培养基 (1 L)

   VB	10 ml
   VC	10 ml
   肌醇	10 ml
   微量	10 ml
   铁盐	10 ml
   甘氨酸	10 ml
   大量元素	100 ml
   蔗糖	40 g
   麦芽提取物	0.5 g
   L-谷氨酰胺	1.5 g

3. MT播种培养基 (1 L)

   VB	10 ml
   VC	10 ml
   肌醇	10 ml
   微量	10 ml
   铁盐	10 ml
   甘氨酸	10 ml
   大量元素	100 ml
   蔗糖	25 g
   琼脂	8 g

4. 生芽培养基 (1 L)

   VB	10 ml
   VC	10 ml
   肌醇	10 ml
   微量	10 ml
   铁盐	10 ml
   甘氨酸	10 ml
   大量元素	100 ml
   蔗糖	40 g
   BA	0.5 mg
   KT	0.5 mg
   NAA	0.1 mg
   琼脂	8 g

5. 伸长培养基 (1 L)

   VB	10 ml
   VC	10 ml
   肌醇	10 ml
   微量	10 ml
   铁盐	10 ml
   甘氨酸	10 ml
   大量元素	100 ml
   蔗糖	40 g
   BA	0.1 mg
   IAA	0.5 mg
   GA3	0.5 mg
   琼脂	8 g

6. 生根培养基 (1 L)

   VB	10 ml
   VC	10 ml
   肌醇	10 ml
   微量	10 ml
   铁盐	10 ml
   甘氨酸	10 ml
   大量元素	50 ml
   蔗糖	25 g
   IBA	0.1 mg
   NAA	0.5 mg
   活性炭	0.5 g
   琼脂	8 g

   注：以上培养基PH应调到5.8-6.0之间，配好分装灭菌后使用，各类激素可配成母液按照相对应的量吸取加入即可。
7. 液体LB培养基 (1 L)

   蛋白胨	10 g
   酵母提取物	5 g
   氯化钠	10 g

8. 固体LB培养基 (1 L)

   蛋白胨	10 g
   酵母提取物	5 g
   氯化钠	10 g
   琼脂	15 g

   注：固体液体培养基均不需要调pH，配好分装灭菌后使用。
9. YEB培养基 (1 L)

   蛋白胨	1 g
   酵母提取物	5 g
   水解络蛋白	5 g
   七水硫酸镁	0.493 g
   琼脂	15-20 g

   注：YEB培养基pH为7.0，可不调pH。