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水稻超氧化物歧化酶(SOD)活性测定   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是一种清除超氧阴离子自由基的酶,逆境环境导致超氧阴离子自由基的积累,诱导植物体内产生SOD。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基,超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收峰。而SOD可清除超氧阴离子自由基,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。
实验目的:检测水稻受到生物逆境处理后,体内超氧化物歧化酶(SOD)活性及清除活性氧的能力。

关键词: 水稻, 氮蓝四唑(NBT), 超氧化物歧化酶SOD, 生物逆境

材料与试剂

  1. 样品袋
  2. 冰盒
  3. 10 ml离心管
  4. 2 ml离心管
  5. 遮光物
  6. Na2HPO4 (天净光复科技发展有限公司)
  7. NaH2PO4 (天净光复科技发展有限公司)
  8. 甲硫氨酸 (Met) (武汉创新生物技术有限公司, catalog number: BA1081)
  9. EDTA-Na2 (生工生物, catalog number: E0105-500g)
  10. 氮蓝四唑 (NBT)
  11. 0.05 mol/L磷酸缓冲液 (见溶液配方)
  12. 130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液 (见溶液配方)
  13. 750 µmol/L氮蓝四唑溶液 (见溶液配方)
  14. 100 µmol/L EDTA-Na2溶液 (见溶液配方)
  15. 20 µmol/L核黄素溶液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. pH试纸 (Sigma, catalog number: P-4536)或pH计(Satorius, catalog number: PB-10)
  2. 剪刀
  3. 研钵
  4. 冷冻离心机 (Eppendorf, model: centrifuge 5417R)
  5. 分析天平 (Adventurer, USA)
  6. 分光光度计 (BECKMAN DU® 640 Spectrophotometer)

实验步骤

  1. 水稻组织样品准备,到温室或田间取样,立即放置于样品袋中,存放于冰盒中带回实验室。
  2. 酶液提取
    在天平上迅速称取水稻组织0.3-0.5 g,剪刀剪碎到预冷的研钵中,加1 ml预冷的磷酸缓冲液,在冰浴上研磨成浆,研磨过程中补加缓冲液使终体积为4 ml。将研磨液倒于10 ml离心管中,4 °C 5,000 x g离心10 min。上清液即为SOD粗提液。
  3. 显色反应
    取2 ml离心管若干 (要求透明度好),其中2个离心管做对照用,按下表加入各种溶液,各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处,其他各管迅速混匀,放置于光照培养室中反应10 min-30 min (保证各管受光情况一致,温度高时间缩短,温度低时间延长)。
  4. SOD活性测定,至反应结束后,全部移入冰盒中,其上可覆盖遮光物,再冷冻离心12,000 x g后取适量反应液测定,以不照光的对照管作空白,分别测定其他各管的吸光度。
    注意:用放在暗处的缓冲液代替酶液的空白管调零,各试剂按比例混合好 (1.3 ml缓冲液 + 0.16 ml甲硫氨酸 + 0.16 ml氮蓝四唑 + 0.16 ml EDTA Na2 + 0.06 ml蒸馏水) (表1),再加60 μl酶液,核黄素0.16 ml最后单独加入,总体积2.0 ml。

    表1. SOD活性测定的试剂量


  5. SOD活性计算,计算公式:
    SOD (U/g.FW) = (Ack-AE) * VT/Ack/0.5/W/Vs
    公式中式符号表示:
    VT-总酶液量(ml)
    Vs-所用酶液量(50 μl)
    W-叶片鲜重(g)
    Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度
    AE-样品管吸光度

注意事项

  1. 为了保证较好的实验结果,测定生理指标时,所有检测样品质量保持相近。
  2. 研磨过程中可先加磷酸缓冲液3 ml,最后再用1 ml磷酸缓冲液清洗研钵中残留。
  3. 如果是老叶片或胁迫后含水量较低叶片,可多加磷酸缓冲液至5-6 ml,具体用量视样品质量及组织情况而定。
  4. 操作过程很多需要冰上操作,应严格执行,否则会影响酶活的测定结果。

溶液配方

  1. 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)
    91.5 ml 0.05 M Na2HPO4
    8.5 ml 0.05M NaH2PO4
  2. 130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液
    称1.9399 g Met用磷酸缓冲液定容至100 ml
  3. 750 µmol/L氮蓝四唑溶液
    称取0.06133 g NBT用磷酸缓冲液定容至100 ml,避光保存
  4. 100 µmol/L EDTA-Na2溶液
    称取0.03721 g EDTA-Na2,用磷酸缓冲液定容至1,000 ml
  5. 20 µmol/L核黄素溶液
    称取0.0753 g核黄素用蒸馏水定容至1,000 ml,避光保存
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:都浩, 王妮丽, 熊立仲. (2018). 水稻超氧化物歧化酶(SOD)活性测定. Bio-101: e1010162. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010162.
How to cite: Du, H., Wang, N. L. and Xiong, L. Z. (2018). Determination of Superoxide Dismutase (SOD) Activity in Rice. Bio-101: e1010162. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010162.
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