水稻组织石蜡切片   

材料与试剂

1. 载玻片及盖玻片
   
2. 甲醛 (国药试剂)
   
3. 冰乙酸 (国药试剂)
   
4. 二甲苯 (国药试剂)
   
5. 无水乙醇 (国药试剂)
   
6. 固体石蜡
   
7. 番红 
   
8. 固绿
   
9. 甲苯胺蓝
   
10. 加拿大树胶
    
11. 50% FAA固定液 (见溶液配方)
    
12. 70% FAA固定液 (见溶液配方)
    
13. 0.5%甲苯胺蓝溶液 (见溶液配方)
    
14. 1%番红 (见溶液配方)
    
15. 1%固绿 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 切片机及刀片
   
2. 粘片台
   
3. 恒温箱
   

实验步骤

1. 取材与固定：将所需材料尽量剪小，加入预冷的FAA固定液中，固定液体积应不少于材料体积的10倍。固定液放冰上，抽真空15 min，缓慢放气，再重复两次，直到材料沉底。
   注：抽真空时要避免固定液沸腾，以免破坏细胞结构。因为抽真空时会导致固定液大量挥发，成分改变，抽完真空要将固定液倒出，换新鲜的固定液，固定过夜。
   
2. FAA固定液固定样品1-2天，可直接用于下面的操作，如需较长时间保存，应移至70%酒精中可保存数月。
   
3. 脱水：将样品移至做石蜡切片的小瓶中，进行脱水步骤前，首先要用相应浓度的乙醇溶液洗去固定液中的甲醛、乙酸。如用50% FAA固定的，要先用50%乙醇替换固定液，一般换三次，每次30 min；如果是用70% FAA固定，先用70%乙醇洗掉固定液，换三次，每次30 min。然后梯度乙醇脱水：
   
   注：此处伊红或曙红目的是组织着色，方便包埋及修蜡块。
   
4. 继续脱水和透明（可以用二甲苯或氯仿），二甲苯透明：
   
   氯仿透明：
   
   
5. 浸蜡：
   
   
6. 包埋：预先折好纸盒，并在电磁炉上熔化新的石蜡，置于60 °C温箱中备用，注意包埋蜡温度不要过高，以免烫坏组织。包埋时，先铺一层包埋蜡，再将玻璃瓶中的材料倒进纸盒中，镊子稍加热，均匀排列材料。让材料自然冷却，可第二天再收。注意包埋蜡不要倒太多，蜡块厚度以1-2 cm为宜，太厚不好切片。
   
7. 修蜡块：将冷却好的蜡块从纸盒中取出，翻过来，可看到被伊红或曙红染色的材料。用单面刀将材料修成上窄下宽的梯形台。注意上面被刀片切割的平面要呈长方形，如果被切割的面不平行，切出的蜡带将不能成为直带。修块时要根据需要将材料摆成纵切或横切的方向，比如切子房、SAM需要纵切，而花药需要横切。
   
8. 粘接：在切片前需要将蜡块粘在长方体的蜡座上，一般用长方体的小木块，避免用圆形的离心管等。将刀片粘少许碎蜡在酒精灯上烧热，抹在木块上，迅速将蜡块粘在木块上，冷却后就可以粘牢了。
   
9. 切片：将小木块夹在切片机样品台上，将蜡块平行对准刀片，调整好切片厚度，旋转切片机把手，开始切片。用笔杆或刀柄接蜡带，在切片完毕，将蜡带小心平铺在干净的纸上。如果切片时蜡带向上翻卷，应小心用镊子将蜡带向下压，使其贴向刀面。如果蜡带从中间劈开，说明刀锋被划伤或者粘到蜡，可用面巾纸顺着刀锋的方向将刀锋擦净，或者挪动刀片，换个切口。如果切片不能呈连续的蜡带，或蜡带中出现较多空洞，说明蜡没有均匀的渗透到样品中，此时尽可能重新取材，在取材后将材料进一步剪小，并适当延长脱水、透明和浸蜡各步骤的处理时间，使蜡渗透充分。
   
10. 粘片和展片：要使蜡带牢固的粘在载玻片上，要先将载玻片涂上粘片剂。推荐使用0.1% poly-L-lysine溶液 (Sigma或生工)。抹片方法：在超净台上，先铺一张干净的A4纸张，将载玻片正面朝上排成两列摆在纸上 (磨砂面方便用铅笔写字，为正面)。在其中一列载玻片中央加20 μl poly-L-lysine，然后依次将滴有poly-L-lysine的和无poly-L-lysine的载玻片面对面涂抹均匀，注意不要有气泡，涂完后放置在干净的切片盒中。37 °C烘干，至少1 h。
    注：磨砂面在粘片时一定要注明样品的名称。
    
11. 展片：展片时，将需要的蜡带切成小段，平铺在载玻片上，在载玻片上滴加双蒸水，使蜡带完全漂浮在双蒸水上。将载玻片移至40 °C展片台上，放置不超过5 min，用面巾纸吸走多余的水分，放入切片盒中，38-42 °C烘干，一般2-3天。
    注：展好片的样品可以在室温干净地方长期放置备用。
    
12. 脱蜡和复水：
    
    注：目的是将石蜡脱去，换成水溶性溶液，以备水溶性染料进入组织染色，因为二甲苯为挥发性有毒液体，此步骤应在通风橱中完成，并且二甲苯是可以回收重复利用的。
    
13. 染色：染色可用0.5%甲苯胺蓝溶液染色30 min至1 h。如果用番红固绿复染，先用1%番红染色 (番红溶解于蒸馏水中) 2-3 min，在后续的脱水环节染固绿 (固绿溶解于95%乙醇) 1-3 min。(染料溶液见溶液配方)
    
14. 脱水、透明：
    可用步骤12中的脱蜡和复水的染缸反顺序使用。
    
    
15. 封片：封片剂推荐使用加拿大树胶。使用前，树胶需要用二甲苯稀释 (体积比1:2-1:6)，向试剂瓶中先倒入加拿大树胶原液，再加入二甲苯，用玻璃棒搅拌均匀，最终稀释成浅黄色、较粘稠的状态，太稠或太稀封片效果都不好。封片时，用镊子将切片从二甲苯中取出，平铺在面巾纸上，趁二甲苯没有挥发掉之前滴加一到两滴封片剂，用镊子夹取一张干净的盖玻片，将盖玻片左侧边缘接触二甲苯，缓缓放下盖玻片，尽量避免产生气泡。如果有气泡，用镊子小心推盖玻片，赶走气泡。待在通风橱中吹15 min，再平铺在摊片盒上，37-40 °C恒温箱中过夜烘干。
    
16. 切片在显微镜下观察拍照，或存于切片盒中长期保存。
    

注意事项

1. 50% FAA适用于幼穗、SAM等幼嫩组织的固定，70% FAA适用于根、茎秆、叶片等成熟组织的固定。配制好的固定液若长期保存应保存在4 °C。
   
2. FAA固定液长时间保存样品会使组织变性，不超过2天，70%酒精可保存数月，更高浓度酒精会使材料收缩。
   
3. 在取水稻叶片固定时，由于叶片表皮蜡质层疏水叶片不易下沉，可在上面塞些纱布使叶片沉在液面以下，抽完真空叶片沉下后再弃纱布。
   
4. 番红是碱性染料，番红是细胞学和动植物组织学生常用的染料，能染细胞核、染色体和植物蛋白质，也可以染孢子囊。固绿是酸性染料，就维管束来说木质部染红色、韧皮部染绿色，导管可以被番红染色,筛管可以被固绿染色。子房、花药等建议用甲苯胺蓝或苏木精染色，爱氏苏木精整体染色法参见附录1。
   
5. 较硬组织如成熟的水稻茎秆、节、种子可用15%氢氟酸抽真空、浸泡过夜，组织较软后再用FAA固定。
   
6. 幼嫩材料用FAA (50%酒精) 代替FAA (70%酒精)，可防止材料收缩，还可加入5 ml甘油以防蒸发和材料变硬。
   

溶液配方

1. 50% FAA固定液 (100 ml)
   

   无水乙醇	50 ml
   37%甲醛溶液	10 ml
   冰乙酸	5 ml

   补充双蒸水定容至 100 ml
   
2. 70% FAA固定液 (100 ml)
   

   无水乙醇	70 ml
   37%甲醛溶液	10 ml
   冰乙酸	5 ml

   补充双蒸水定容至 100 ml
   
3. 1%番红
   1 g番红溶解在100 ml双蒸水中
   
4. 1%固绿
   1 g固绿溶解在100 ml 95%乙醇中
   
5. 0.5%甲苯胺蓝
   0.5 g甲苯胺蓝溶解在100 ml双蒸水中