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水稻组织石蜡切片   

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实验原理:用石蜡包埋组织块制作的显微切片。经取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。在显微镜下可清晰观察细胞组织的形态结构。
实验目的:石蜡切片是研究细胞生物学的基础技术,不仅是研究组织细胞形态的重要手段,更是RNA原位杂交、TUNEL法检测细胞凋亡、免疫组织化学等分子细胞生物学的基本步骤。

关键词: 固定, 包埋, 组织切片

材料与试剂

  1. 载玻片及盖玻片
  2. 甲醛 (国药试剂)
  3. 冰乙酸 (国药试剂)
  4. 二甲苯 (国药试剂)
  5. 无水乙醇 (国药试剂)
  6. 固体石蜡
  7. 番红 
  8. 固绿
  9. 甲苯胺蓝
  10. 加拿大树胶
  11. 50% FAA固定液 (见溶液配方)
  12. 70% FAA固定液 (见溶液配方)
  13. 0.5%甲苯胺蓝溶液 (见溶液配方)
  14. 1%番红 (见溶液配方)
  15. 1%固绿 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 切片机及刀片
  2. 粘片台
  3. 恒温箱

实验步骤

  1. 取材与固定:将所需材料尽量剪小,加入预冷的FAA固定液中,固定液体积应不少于材料体积的10倍。固定液放冰上,抽真空15 min,缓慢放气,再重复两次,直到材料沉底。
    注:抽真空时要避免固定液沸腾,以免破坏细胞结构。因为抽真空时会导致固定液大量挥发,成分改变,抽完真空要将固定液倒出,换新鲜的固定液,固定过夜。
  2. FAA固定液固定样品1-2天,可直接用于下面的操作,如需较长时间保存,应移至70%酒精中可保存数月。
  3. 脱水:将样品移至做石蜡切片的小瓶中,进行脱水步骤前,首先要用相应浓度的乙醇溶液洗去固定液中的甲醛、乙酸。如用50% FAA固定的,要先用50%乙醇替换固定液,一般换三次,每次30 min;如果是用70% FAA固定,先用70%乙醇洗掉固定液,换三次,每次30 min。然后梯度乙醇脱水:

    注:此处伊红或曙红目的是组织着色,方便包埋及修蜡块。
  4. 继续脱水和透明(可以用二甲苯或氯仿),二甲苯透明:

    氯仿透明:

  5. 浸蜡:

  6. 包埋:预先折好纸盒,并在电磁炉上熔化新的石蜡,置于60 °C温箱中备用,注意包埋蜡温度不要过高,以免烫坏组织。包埋时,先铺一层包埋蜡,再将玻璃瓶中的材料倒进纸盒中,镊子稍加热,均匀排列材料。让材料自然冷却,可第二天再收。注意包埋蜡不要倒太多,蜡块厚度以1-2 cm为宜,太厚不好切片。
  7. 修蜡块:将冷却好的蜡块从纸盒中取出,翻过来,可看到被伊红或曙红染色的材料。用单面刀将材料修成上窄下宽的梯形台。注意上面被刀片切割的平面要呈长方形,如果被切割的面不平行,切出的蜡带将不能成为直带。修块时要根据需要将材料摆成纵切或横切的方向,比如切子房、SAM需要纵切,而花药需要横切。
  8. 粘接:在切片前需要将蜡块粘在长方体的蜡座上,一般用长方体的小木块,避免用圆形的离心管等。将刀片粘少许碎蜡在酒精灯上烧热,抹在木块上,迅速将蜡块粘在木块上,冷却后就可以粘牢了。
  9. 切片:将小木块夹在切片机样品台上,将蜡块平行对准刀片,调整好切片厚度,旋转切片机把手,开始切片。用笔杆或刀柄接蜡带,在切片完毕,将蜡带小心平铺在干净的纸上。如果切片时蜡带向上翻卷,应小心用镊子将蜡带向下压,使其贴向刀面。如果蜡带从中间劈开,说明刀锋被划伤或者粘到蜡,可用面巾纸顺着刀锋的方向将刀锋擦净,或者挪动刀片,换个切口。如果切片不能呈连续的蜡带,或蜡带中出现较多空洞,说明蜡没有均匀的渗透到样品中,此时尽可能重新取材,在取材后将材料进一步剪小,并适当延长脱水、透明和浸蜡各步骤的处理时间,使蜡渗透充分。
  10. 粘片和展片:要使蜡带牢固的粘在载玻片上,要先将载玻片涂上粘片剂。推荐使用0.1% poly-L-lysine溶液 (Sigma或生工)。抹片方法:在超净台上,先铺一张干净的A4纸张,将载玻片正面朝上排成两列摆在纸上 (磨砂面方便用铅笔写字,为正面)。在其中一列载玻片中央加20 μl poly-L-lysine,然后依次将滴有poly-L-lysine的和无poly-L-lysine的载玻片面对面涂抹均匀,注意不要有气泡,涂完后放置在干净的切片盒中。37 °C烘干,至少1 h。
    注:磨砂面在粘片时一定要注明样品的名称。
  11. 展片:展片时,将需要的蜡带切成小段,平铺在载玻片上,在载玻片上滴加双蒸水,使蜡带完全漂浮在双蒸水上。将载玻片移至40 °C展片台上,放置不超过5 min,用面巾纸吸走多余的水分,放入切片盒中,38-42 °C烘干,一般2-3天。
    注:展好片的样品可以在室温干净地方长期放置备用。
  12. 脱蜡和复水:

    注:目的是将石蜡脱去,换成水溶性溶液,以备水溶性染料进入组织染色,因为二甲苯为挥发性有毒液体,此步骤应在通风橱中完成,并且二甲苯是可以回收重复利用的。
  13. 染色:染色可用0.5%甲苯胺蓝溶液染色30 min至1 h。如果用番红固绿复染,先用1%番红染色 (番红溶解于蒸馏水中) 2-3 min,在后续的脱水环节染固绿 (固绿溶解于95%乙醇) 1-3 min。(染料溶液见溶液配方)
  14. 脱水、透明:
    可用步骤12中的脱蜡和复水的染缸反顺序使用。

  15. 封片:封片剂推荐使用加拿大树胶。使用前,树胶需要用二甲苯稀释 (体积比1:2-1:6),向试剂瓶中先倒入加拿大树胶原液,再加入二甲苯,用玻璃棒搅拌均匀,最终稀释成浅黄色、较粘稠的状态,太稠或太稀封片效果都不好。封片时,用镊子将切片从二甲苯中取出,平铺在面巾纸上,趁二甲苯没有挥发掉之前滴加一到两滴封片剂,用镊子夹取一张干净的盖玻片,将盖玻片左侧边缘接触二甲苯,缓缓放下盖玻片,尽量避免产生气泡。如果有气泡,用镊子小心推盖玻片,赶走气泡。待在通风橱中吹15 min,再平铺在摊片盒上,37-40 °C恒温箱中过夜烘干。
  16. 切片在显微镜下观察拍照,或存于切片盒中长期保存。

注意事项

  1. 50% FAA适用于幼穗、SAM等幼嫩组织的固定,70% FAA适用于根、茎秆、叶片等成熟组织的固定。配制好的固定液若长期保存应保存在4 °C。
  2. FAA固定液长时间保存样品会使组织变性,不超过2天,70%酒精可保存数月,更高浓度酒精会使材料收缩。
  3. 在取水稻叶片固定时,由于叶片表皮蜡质层疏水叶片不易下沉,可在上面塞些纱布使叶片沉在液面以下,抽完真空叶片沉下后再弃纱布。
  4. 番红是碱性染料,番红是细胞学和动植物组织学生常用的染料,能染细胞核、染色体和植物蛋白质,也可以染孢子囊。固绿是酸性染料,就维管束来说木质部染红色、韧皮部染绿色,导管可以被番红染色,筛管可以被固绿染色。子房、花药等建议用甲苯胺蓝或苏木精染色,爱氏苏木精整体染色法参见附录1
  5. 较硬组织如成熟的水稻茎秆、节、种子可用15%氢氟酸抽真空、浸泡过夜,组织较软后再用FAA固定。
  6. 幼嫩材料用FAA (50%酒精) 代替FAA (70%酒精),可防止材料收缩,还可加入5 ml甘油以防蒸发和材料变硬。

溶液配方

  1. 50% FAA固定液 (100 ml)
    无水乙醇
    50 ml
    37%甲醛溶液
    10 ml
    冰乙酸
    5 ml
    补充双蒸水定容至 100 ml
  2. 70% FAA固定液 (100 ml)
    无水乙醇
    70 ml
    37%甲醛溶液
    10 ml
    冰乙酸
    5 ml
    补充双蒸水定容至 100 ml
  3. 1%番红
    1 g番红溶解在100 ml双蒸水中
  4. 1%固绿
    1 g固绿溶解在100 ml 95%乙醇中
  5. 0.5%甲苯胺蓝
    0.5 g甲苯胺蓝溶解在100 ml双蒸水中
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:程珂, 都浩, 欧阳亦聃. (2018). 水稻组织石蜡切片. Bio-101: e1010140. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010140.
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