Paraffin Embedding Rice Tissues and Sectioning   

材料与试剂

1. 载玻片及盖玻片
   
2. 甲醛 (国药试剂)
   
3. 冰乙酸 (国药试剂)
   
4. 二甲苯 (国药试剂)
   
5. 无水乙醇 (国药试剂)
   
6. 固体石蜡
   
7. 番红 
   
8. 固绿
   
9. 甲苯胺蓝
   
10. 加拿大树胶
    
11. 50% FAA固定液 (见溶液配方)
    
12. 70% FAA固定液 (见溶液配方)
    
13. 0.5%甲苯胺蓝溶液 (见溶液配方)
    
14. 1%番红 (见溶液配方)
    
15. 1%固绿 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 切片机及刀片
   
2. 粘片台
   
3. 恒温箱
   

实验步骤

1. 取材与固定：将所需材料尽量剪小，加入预冷的FAA固定液中，固定液体积应不少于材料体积的10倍。固定液放冰上，抽真空15 min，缓慢放气，再重复两次，直到材料沉底。
   注：抽真空时要避免固定液沸腾，以免破坏细胞结构。因为抽真空时会导致固定液大量挥发，成分改变，抽完真空要将固定液倒出，换新鲜的固定液，固定过夜。
   
2. FAA固定液固定样品1-2天，可直接用于下面的操作，如需较长时间保存，应移至70%酒精中可保存数月。
   
3. 脱水：将样品移至做石蜡切片的小瓶中，进行脱水步骤前，首先要用相应浓度的乙醇溶液洗去固定液中的甲醛、乙酸。如用50% FAA固定的，要先用50%乙醇替换固定液，一般换三次，每次30 min；如果是用70% FAA固定，先用70%乙醇洗掉固定液，换三次，每次30 min。然后梯度乙醇脱水：
   
   注：此处伊红或曙红目的是组织着色，方便包埋及修蜡块。
   
4. 继续脱水和透明（可以用二甲苯或氯仿），二甲苯透明：
   
   氯仿透明：
   
   
5. 浸蜡：
   
   
6. 包埋：预先折好纸盒，并在电磁炉上熔化新的石蜡，置于60 °C温箱中备用，注意包埋蜡温度不要过高，以免烫坏组织。包埋时，先铺一层包埋蜡，再将玻璃瓶中的材料倒进纸盒中，镊子稍加热，均匀排列材料。让材料自然冷却，可第二天再收。注意包埋蜡不要倒太多，蜡块厚度以1-2 cm为宜，太厚不好切片。
   
7. 修蜡块：将冷却好的蜡块从纸盒中取出，翻过来，可看到被伊红或曙红染色的材料。用单面刀将材料修成上窄下宽的梯形台。注意上面被刀片切割的平面要呈长方形，如果被切割的面不平行，切出的蜡带将不能成为直带。修块时要根据需要将材料摆成纵切或横切的方向，比如切子房、SAM需要纵切，而花药需要横切。
   
8. 粘接：在切片前需要将蜡块粘在长方体的蜡座上，一般用长方体的小木块，避免用圆形的离心管等。将刀片粘少许碎蜡在酒精灯上烧热，抹在木块上，迅速将蜡块粘在木块上，冷却后就可以粘牢了。
   
9. 切片：将小木块夹在切片机样品台上，将蜡块平行对准刀片，调整好切片厚度，旋转切片机把手，开始切片。用笔杆或刀柄接蜡带，在切片完毕，将蜡带小心平铺在干净的纸上。如果切片时蜡带向上翻卷，应小心用镊子将蜡带向下压，使其贴向刀面。如果蜡带从中间劈开，说明刀锋被划伤或者粘到蜡，可用面巾纸顺着刀锋的方向将刀锋擦净，或者挪动刀片，换个切口。如果切片不能呈连续的蜡带，或蜡带中出现较多空洞，说明蜡没有均匀的渗透到样品中，此时尽可能重新取材，在取材后将材料进一步剪小，并适当延长脱水、透明和浸蜡各步骤的处理时间，使蜡渗透充分。
   
10. 粘片和展片：要使蜡带牢固的粘在载玻片上，要先将载玻片涂上粘片剂。推荐使用0.1% poly-L-lysine溶液 (Sigma或生工)。抹片方法：在超净台上，先铺一张干净的A4纸张，将载玻片正面朝上排成两列摆在纸上 (磨砂面方便用铅笔写字，为正面)。在其中一列载玻片中央加20 μl poly-L-lysine，然后依次将滴有poly-L-lysine的和无poly-L-lysine的载玻片面对面涂抹均匀，注意不要有气泡，涂完后放置在干净的切片盒中。37 °C烘干，至少1 h。
    注：磨砂面在粘片时一定要注明样品的名称。
    
11. 展片：展片时，将需要的蜡带切成小段，平铺在载玻片上，在载玻片上滴加双蒸水，使蜡带完全漂浮在双蒸水上。将载玻片移至40 °C展片台上，放置不超过5 min，用面巾纸吸走多余的水分，放入切片盒中，38-42 °C烘干，一般2-3天。
    注：展好片的样品可以在室温干净地方长期放置备用。
    
12. 脱蜡和复水：
    
    注：目的是将石蜡脱去，换成水溶性溶液，以备水溶性染料进入组织染色，因为二甲苯为挥发性有毒液体，此步骤应在通风橱中完成，并且二甲苯是可以回收重复利用的。
    
13. 染色：染色可用0.5%甲苯胺蓝溶液染色30 min至1 h。如果用番红固绿复染，先用1%番红染色 (番红溶解于蒸馏水中) 2-3 min，在后续的脱水环节染固绿 (固绿溶解于95%乙醇) 1-3 min。(染料溶液见溶液配方)
    
14. 脱水、透明：
    可用步骤12中的脱蜡和复水的染缸反顺序使用。
    
    
15. 封片：封片剂推荐使用加拿大树胶。使用前，树胶需要用二甲苯稀释 (体积比1:2-1:6)，向试剂瓶中先倒入加拿大树胶原液，再加入二甲苯，用玻璃棒搅拌均匀，最终稀释成浅黄色、较粘稠的状态，太稠或太稀封片效果都不好。封片时，用镊子将切片从二甲苯中取出，平铺在面巾纸上，趁二甲苯没有挥发掉之前滴加一到两滴封片剂，用镊子夹取一张干净的盖玻片，将盖玻片左侧边缘接触二甲苯，缓缓放下盖玻片，尽量避免产生气泡。如果有气泡，用镊子小心推盖玻片，赶走气泡。待在通风橱中吹15 min，再平铺在摊片盒上，37-40 °C恒温箱中过夜烘干。
    
16. 切片在显微镜下观察拍照，或存于切片盒中长期保存。
    

注意事项

1. 50% FAA适用于幼穗、SAM等幼嫩组织的固定，70% FAA适用于根、茎秆、叶片等成熟组织的固定。配制好的固定液若长期保存应保存在4 °C。
   
2. FAA固定液长时间保存样品会使组织变性，不超过2天，70%酒精可保存数月，更高浓度酒精会使材料收缩。
   
3. 在取水稻叶片固定时，由于叶片表皮蜡质层疏水叶片不易下沉，可在上面塞些纱布使叶片沉在液面以下，抽完真空叶片沉下后再弃纱布。
   
4. 番红是碱性染料，番红是细胞学和动植物组织学生常用的染料，能染细胞核、染色体和植物蛋白质，也可以染孢子囊。固绿是酸性染料，就维管束来说木质部染红色、韧皮部染绿色，导管可以被番红染色,筛管可以被固绿染色。子房、花药等建议用甲苯胺蓝或苏木精染色，爱氏苏木精整体染色法参见附录1。
   
5. 较硬组织如成熟的水稻茎秆、节、种子可用15%氢氟酸抽真空、浸泡过夜，组织较软后再用FAA固定。
   
6. 幼嫩材料用FAA (50%酒精) 代替FAA (70%酒精)，可防止材料收缩，还可加入5 ml甘油以防蒸发和材料变硬。
   

溶液配方

1. 50% FAA固定液 (100 ml)
   

   无水乙醇	50 ml
   37%甲醛溶液	10 ml
   冰乙酸	5 ml

   补充双蒸水定容至100 ml
   
2. 70% FAA固定液 (100 ml)
   

   无水乙醇	70 ml
   37%甲醛溶液	10 ml
   冰乙酸	5 ml

   补充双蒸水定容至100 ml
   
3. 1%番红
   1 g番红溶解在100 ml双蒸水中
   
4. 1%固绿
   1 g固绿溶解在100 ml 95%乙醇中
   
5. 0.5%甲苯胺蓝
   0.5 g甲苯胺蓝溶解在100 ml双蒸水中