高通量分析果蝇节律的实验方法
A High-Throughput Method for Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms in Drosophila   

材料与试剂

1. 橡皮筋
2. 锡箔纸
3. 毛笔
4. 带孔塑料塞
5. 野生型果蝇w¹¹¹⁸ (FlyBase ID: FBst0005905)
6. 玉米粉 (食用级)
7. 葡萄糖 (国药，沪试，catalog number: 10010518)
8. 蔗糖 (国药，沪试，catalog number: 10021418)
9. 高活性干酵母 (安琪酵母)
   
10. 无水乙醇 (国药，沪试，catalog number: 10009218)
11. 对羟基苯甲酸甲酯 (国药，沪试，catalog number: 30119426)
12. 丙酸 (国药，沪试，catalog number: 81011918)
13. 琼脂粉 (天津致远)
    

仪器设备

1. 烧杯
2. 果蝇饲养管 (2.5 x 9.5 cm透明聚苯乙烯塑料管)
3. 光照培养箱 (宁波莱福科技有限公司)
4. 果蝇活动监测系统 (Trikinetics, Waltham, MA, USA)
5. 高压蒸汽灭菌器 (日本松下，model: MLS-3751L-PC)
6. 体式显微镜 (重庆奥特光学仪器有限公司)
7. CO₂麻醉板
   

实验步骤

1. 准备待测果蝇
   使用标准果蝇食物饲养果蝇 (温度：25 °C，湿度：50%，光照：12 h光照/12 h黑暗)；监测果蝇年龄应在2-5天；由于雌蝇产卵可能会影响活动监测结果，因此监测活动节律一般使用雄蝇。
2. 准备监测管
   
   1. 用橡皮筋将洁净干燥的玻璃管 (约160根) 扎好后垂直放入500 ml烧杯中，用锡箔纸包裹杯口，准备灭菌。
   2. 用双蒸水配置含5%蔗糖和2%琼脂的食物溶液，锡箔纸封住杯口后与监测管一同灭菌。
   3. 待灭菌结束后取出监测管和食物，用移液管将食物沿壁加入烧杯中 (每个烧杯加入50 ml)，待其冷却凝固。
   4. 从烧杯中取出监测管，擦净监测管外壁残余食物，用塑料塞封住食物端。
3. 装配果蝇
   
   1. 用二氧化碳麻醉果蝇。
      注：由于二氧化碳麻醉会对果蝇产生不利影响，麻醉时间应避免超过5 min。
   2. 用毛笔将果蝇移入监测管中 (一根监测管一只果蝇)。
   3. 将装入果蝇的监测管插入监测板中，并用带孔塑料塞封住非食物端。
      注：尽量将同一基因型同一性别的果蝇装在同一块监测板中，并准确记录果蝇基因型及其对应监测板号码和监测管位置。
   4. 待监测板上果蝇装配完成后，尽量使监测管中部 (无食物部分) 对准监测板上红外线发射/接收处，并用橡皮筋固定每根监测管 (图1)。
      
      
      图1. 果蝇活动监测板实物图。图中所示为橡皮筋固定监测管食物端，每两排监测管用一根皮筋固定。
      
      
      
4. 将监测板放入预先设置好温度、湿度的培养箱中，并用电话线将其与数据收集系统相连。
5. 在电脑上打开数据收集软件，设置收集数据间隔为1 min并确认连接好的监测板已开始收集数据。
   注：一旦开始监测，一直到监测结束，如无必要请勿打开培养箱以免影响果蝇活动导致监测结果受影响。
6. 设置培养箱监测期间光照变化程序，一般是7天12 h光照/12 h黑暗 (LD)，接下来7天持续黑暗 (DD)。设置完成后即可等待监测结束。
   注：7天DD活动数据可用于分析计算果蝇活动节律的周期、强度和节律果蝇占比等相关参数。
   

结果与分析

1. 收集并处理数据
   
   1. 监测结束后将所收集的数据复制到新文件夹中，然后将其导入DAMFileScan软件 (版本：1.0.7.0，Trikinetics) 中。
   2. 在DAMFileScan软件中转换数据格式：在“Bin Length”处设置数据间隔为
      30 min；在“Output File Type”处设置输出数据文件格式为“Channel Files”；在左侧“First Bin to Save”处设置数据开始日期，时间设置为“00:30:00”；在右侧“Last Bin to Save”处设置数据结束日期，时间设置为最近的时间 (例如，下午三点收集数据，则时间设置为“15:00:00”)；在“Extra Readings”处选择“Sum into Bin”；在“RunName”处为导出数据命名；最后点击“Save”保存即可。
      注：转换数据格式时尽量均以所要分析数据第一天为开始日期，便于后期不同批次实验数据结合。
2. 分析节律
   节律分析使用ClockLab软件 (Actimetrics，版本：2.72)，以30 min为间隔计算周期 (图2)。
   
   1. 通过MATLAB打开ClockLab，打开“MATLAB”输入“CL”后点击回车。
   2. 点击界面左上角“Open File”键，从转换格式后的文件中任选一个。
   3. 在右下方面板中的“Block Size”处选择数据间隔为30 min，“Start/End Hour”处均选为0。
   4. 设置节律性分析的参数
      点击界面右上方“Preferences”键，然后在弹出界面中“Periodogram”下方“Confidence”处设置置信水平为0.01，在“Range”处设置周期时长范围 (最低限为17 h，最高限为40 h)，然后关闭该界面。
   5. 选择数据分析日期
      在主界面中“Start/End Dates”处设置开始日期为DD第1天的日期，结束日期为收集数据的日期。
   6. 节律性分析
      点击主界面左下角“Batch Analysis”键，在弹出界面中选中需要分析的数据；在右边面板中确认并勾选相关参数：“P’gram peak1” (卡方周期图分析，日期设为全部持续黑暗时间段)，“Avg Counts” (平均活动量，日期设为持续黑暗最后一天) 等，点击“Go”开始分析。
   7. 节律分析结果说明
      分析结束后结果生成“BatchAnal”文件，使用Excel打开。其中主要参数有以下几项：
      
      1)

      “Tau”：通过卡方周期图计算出17-40 h之间节律性最强时对应的周期时长，即果蝇活动周期。
      2)

      “power”：该果蝇活动周期所对应的节律性大小。
      3)

      “Significance”：置信水平为0.01且周期在17-40h之间时该果蝇节律性背景值。
   8. 排除死果蝇
      分析每只果蝇DD最后一天的活动，将活动量为0的果蝇删除。
   9. 整理分析结果
      通过“power”与“significance”相减可计算得到“p-s” (表示果蝇节律强弱)，若“p-s”小于10则认为该果蝇没有节律，计算平均周期时将该果蝇排除 (计算节律强度平均值时需保留)。最终得到每种基因型果蝇以下参数：
      
      1)

      果蝇数目“N”；
      2)

      有节律的果蝇占存活果蝇百分比“rhythmic”；
      3)

      果蝇节律性强弱“p-s”；
      4)

      果蝇平均周期长度“Tau”。
      
      
   
   图2. ClockLab软件示意图及单只果蝇节律分析结果图。 A. ClockLab软件操作主界面。B. 单只w¹¹¹⁸雄蝇卡方分析周期图，横坐标表示周期时长，纵坐标表示某一周期时长对应的振幅大小。C. 单只w¹¹¹⁸雄蝇14天活动图，横坐标表示时间 (蓝色区域为白天光照阶段，空白条纹为夜晚黑暗阶段)，纵坐标表示日期 (2号至9号为LD，9号至16号为DD)，黑色小块表示果蝇活动。
   

溶液配方

1. 标准果蝇食物配方
   琼脂粉 5 g
   蔗糖 31.62 g
   葡萄糖 63.2 g
   玉米粉 77.7 g
   酵母 30 g
   丙酸 4.3 ml
   10%对羟基苯甲酸甲酯 (溶于无水乙醇) 10 ml
   双蒸水 1 L
2. 活动监测期间果蝇食物配方
   琼脂粉 20 g
   蔗糖 50 g
   双蒸水 1 L
   

致谢

本课题得到国家自然科学基金面上项目 (31471125和31671215) 的支持。