The Evaluation of DNA Double-strand Break Based on 53BP1 foci   

材料与试剂

仪器设备

实验步骤

一、细胞培养

1. HeLa细胞的培养：采用高糖DMEM完全培养基，于5%二氧化碳、37 °C的二氧化碳培养箱中培养。根据实验所需的细胞数量，贴壁培养在25 cm^2或75 cm^2细胞培养瓶中。细胞在培养瓶中增殖，当用倒置显微镜观察到细胞密度达到80%左右时，采用胰酶将细胞消化解离，再接种一小部分到培养瓶中，传代培养；或接种到孔板中进行转染或辐照实验。每3天左右进行一次传代。高糖DMEM完全培养基的配方详见“溶液配方”部分。胰酶消化、接种到孔板的操作于二级生物安全柜中进行，步骤详见“三、细胞种板、化合物预处理、辐照”部分。
2. HeLa-EGFP-53BP1细胞的培养：在培养瓶中培养时，在高糖DMEM完全培养基中额外添加2 μg/ml嘌呤霉素盐酸盐。除此之外，培养方式与HeLa细胞相同（接种到孔板进行实验时，也并不额外添加嘌呤霉素盐酸盐）。嘌呤霉素盐酸盐的配制详见“溶液配方”部分。

1. 构建基因表达慢病毒载体、收集病毒：人TP53BP1基因 (全长1972 aa) 的1220~1711 aa是它的最小focus形成区 (Panier et al., 2014)，将EGFP与人TP53BP1的1220~1711 aa基因序列直接连接，构建EGFP-53BP1(1220~1711 aa)的基因表达慢病毒载体。转染HEK 293T细胞产生慢病毒颗粒。委托云舟生物公司进行基因表达慢病毒载体的构建和慢病毒颗粒的收集，载体图谱如图1所示。该载体携带嘌呤霉素抗性，转染细胞之后，通过在培养时加入嘌呤霉素，选择性杀死未感染的细胞。
   
   
   图1. EGFP-53BP1(1220~1711aa)的基因表达慢病毒载体
   
   
2. 确定嘌呤霉素浓度：将HeLa细胞消化，以高糖DMEM完全培养基重悬，2000个细胞/孔接种于透明96孔细胞培养板，贴壁后给以100 μl/孔的0.5~10 μg/ml嘌呤霉素盐酸盐。每两天更换一次新的嘌呤霉素盐酸盐，观察4天。选取在嘌呤霉素盐酸盐孵育4天时能够杀光孔内全部细胞的最低浓度，为最佳浓度。种板步骤参见“三、细胞种板、化合物预处理、辐照”部分。
3. 转染：以慢病毒转染HeLa细胞，以获得HeLa-EGFP-53BP1稳定转染细胞系。转染前一天，接种细胞于12孔细胞培养板，使得第二天细胞密度为50%左右。转染当天，观察确认细胞密度适宜后，加入病毒和Polybrene，以感染细胞。Polybrene的终浓度为5 μg/ml。所需加入的病毒体积如下计算。取一孔进行细胞计数。MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒个数。所需病毒个数=转染时细胞数*MOI，所需加入的病毒体积=病毒个数/病毒滴度。HeLa的MOI参考值在10~30，通过预实验摸索最佳的MOI值，如将MOI设为10、30、100，选择能达到较好感染效率的最小MOI，即为最佳MOI值。感染后8 h，吸去含病毒和Polybrene的培养基，换上新鲜的高糖DMEM完全培养基继续培养。感染后48 h，倒置荧光显微镜的FITC通道下可观察到核内绿色荧光，如图2。换上含2 μg/ml嘌呤霉素盐酸盐的高糖DMEM完全培养基，继续培养。细胞消化、计数步骤参见“三、细胞种板、化合物预处理、辐照”部分。
   
   
   图2. 感染后的细胞（透射光与绿色荧光的叠加）
   

1. 细胞种板：弃去培养瓶中的培养基，把细胞用2 ml 无菌PBS清洗一遍，再加入胰酶溶液（75 cm^2培养瓶加2 ml胰酶，25 cm^2培养瓶加1 ml胰酶），使胰酶布满细胞所贴附的瓶底，于37 °C培养箱中孵育约1 min，以促使细胞脱离贴壁状态。1 min后从培养箱拿出，显微镜下观察到细胞已从贴壁伸展状态变为即将脱离的圆形状态，代表胰酶作用时间足够，则立刻加3倍于胰酶体积的高糖DMEM完全培养基，以终止胰酶的作用。吹打瓶底以确保细胞完全脱离瓶底。将含细胞的胰酶、高糖DMEM完全培养基混合液全部转移到15 ml离心管中，900 rpm离心5 min，然后去除上清，将细胞沉淀用3~5 ml高糖DMEM完全培养基重悬。取10 μl细胞悬液，与10 μl台盼蓝溶液混合，再吸取10 μl混合液打入细胞计数仪配备的计数板，插入细胞计数仪进行自动计数，以得知活细胞浓度（个/ml）。再用高糖DMEM完全培养基将细胞悬液稀释成5万个活细胞/ml，以100 μl/孔接种在黑色底透96孔细胞培养板中，则每孔接种了5000个活细胞。选用的黑色底透96孔细胞培养板，表面是tissue-culture（TC）处理，可以让细胞贴附；孔壁为黑色，以防止孔间荧光干扰，底为较薄的透明平底以满足高内涵成像仪器的自动对焦需求。设置不接受辐照的板和接受辐照的板。正常对照组安排在不接受辐照的板上。辐照组、化合物处理组安排在接受辐照的板上。
2. 化合物预处理、辐照：细胞贴壁后，对各实验组进行如下处理。
   (1) 辐照组即IR组：设置在接受辐照的板上。在辐照前30 min，将辐照组孔内液体换成100 μl高糖DMEM完全培养基。
   (2) 化合物预处理组：设置在接受辐照的板上。用高糖DMEM完全培养基将WR-1065 盐酸盐或待测化合物从储备溶液稀释成指定浓度。在辐照前30 min，将孔内液体用移液器小心吸去，换成100 μl/孔的含化合物的高糖DMEM完全培养基，使孔内细胞在辐照之前，与化合物溶液预先孵育30 min。
   (3) 正常对照组即Control组：设置在不接受辐照的板上。在辐照板接受辐照之前30 min，将正常对照组孔内液体换成100 μl高糖DMEM完全培养基。
   将辐照组和化合物处理组所在的板放入辐照仪中，暴露于X射线辐照 (50 s=1 Gy)。而正常对照组所在的板不接受辐照。辐照后将细胞再放回二氧化碳培养箱中孵育2 h，随后对上述实验组进行同样的固定、染色操作。

1. 细胞固定、细胞染色：弃去培养液，向孔内加入100 μl室温的4%多聚甲醛溶液，在室温下静置10 min以固定细胞。将“加入100 μl PBS/孔，再吸去”计为用PBS洗涤1次。弃去多聚甲醛溶液，将细胞用PBS洗涤2次。然后，弃去PBS，加入100 μl 1 μg/ml Hoechst 33342，在室温下静置10 min，以对细胞核染色。将染色后的细胞用PBS洗涤3次。最后，将100 μl PBS添加到每个孔中，避免细胞干燥。去除液体的操作都以移液器小心去除，吸头尖部顶住孔底最边缘，尽量避免吸头碰到细胞。加液操作都以移液器小心加入，吸头尖部顶住孔内侧壁，沿壁打入液体，尽量避免液体冲击细胞。固定染色后的样品板在4 °C可储存1个月。由于荧光染料Hoechst 33342 需要避光，从涉及Hoechst 33342 的步骤开始到成像完毕，都避光操作。
2. 图像采集：将样品板恢复至室温，用无尘纸以按压法轻轻擦拭板的底部，以擦去板底上可能存在的影响成像的水汽或灰尘。擦拭力度轻，以防止擦出划痕，影响成像。将擦拭后的样品板放入ImageXpress PICO高内涵成像系统的舱中，选择40倍物镜，添加DAPI通道和FITC通道，调节曝光时间和焦距后，批量拍摄，每个孔拍摄6到12个视野。图3中，正常对照组 (Control) 内，更多的细胞核内EGFP-53BP1 (1220~1711 aa) 融合蛋白弥散分布或仅有少量的foci；辐照组 (IR) 内，融合蛋白大多聚集成foci；参考化合物WR1065盐酸盐 (WR1065 2HCl) 的预处理减缓了辐照带来的foci增多现象。
   
   
   图3. 正常对照组 (Control)、辐照组 (IR)、参考化合物组 (IR + WR1065 2HCl)的代表性图片
   
   
   

1. 打开高内涵系统配套软件，添加分析操作。选择软件提供的分析模块：Autophagy分析模块、Internalization分析模块或Lysosomal degradation分析模块均可。这三种分析模块具有同样的分析逻辑，即：先用核染色通道图片识别细胞核所在位置，再用另一个染色通道图片识别颗粒所在位置；三者均能够适用于分析核内foci的情景。
2. 更改分析模块内的参数。首先，Nuclear Channel选择DAPI，调整Intensity above background、Min width和Max width，使得软件能正确识别到核的位置。其次，Granule Channel选择FITC，调整Intensity above background、Min width和Max width，使软件能正确识别到核内foci的位置。预览分析效果时，软件会自动展示其所识别到的细胞核、核内颗粒、核外颗粒的位置。可通过单击对应图标取消展示，再次单击对应图标重新展示，以将软件识别效果与原荧光图进行对比，方便调整分析模块参数。
3. 运行分析，软件自动分析完成后，导出ExperimentSummaryData.csv文件，比较正常组、辐照组、化合物处理+辐照组的平均颗粒个数。平均颗粒个数Avg Granule Count = Total Granule Count/Total Object Count。由于平均数会受到少数特大或特小的数据影响，所以可以计算foci ≥ 20的细胞在总细胞中的占比 (%)，作为更具有代表性的指标。导出ExperimentCellData.csv文件，求每个孔内foci ≥ 20的细胞个数，除以该孔的总细胞数，相除即得到foci ≥ 20的细胞在总细胞中的占比 (%)。

结果与分析

图4. Foci水平随辐照剂量和参考化合物浓度的变化

由图4可见， foci水平随着辐照剂量（0.5 Gy，1.0　Gy，2.0　Gy）的升高而升高。而随着参考化合物WR-1065 2HCl浓度的升高，foci水平逐渐下降。这符合辐照诱导DSB产生，而WR-1065抑制DSB产生的事实。
选择foci ≥ 20的细胞在总细胞中的占比，来代表foci水平，原因如下。计算了foci ≥ 5细胞占比、foci ≥ 10细胞占比、foci ≥ 20细胞占比、foci ≥ 30细胞占比，比较发现，若采用foci ≥ 5细胞占比、foci ≥ 10细胞占比，则无法区分不同剂量辐照的实验组；而若采用foci ≥ 30细胞占比，则在0.5 Gy剂量辐照下，无法很好地显示出不同浓度参考化合物（WR1065 2HCl）的量效差异（图5）。采用foci ≥ 20细胞占比作为foci水平的指标，显示出了辐照剂量以及参考化合物浓度对细胞群体foci水平的剂量依赖性的影响。


图5. Foci ≥ 5细胞占比、foci ≥ 10细胞占比、foci ≥ 30细胞占比

该细胞模型能够用于毒性试剂、DNA损伤保护试剂的高通量评估。若不给以辐照，仅给以化合物处理就能提高foci水平，则该化合物可能有着诱导DSB的毒性。若给细胞进行辐照前的化合物预处理，“化合物预处理+辐照”组相比于辐照组，foci水平有所降低，那么可以结合中性彗星实验进一步确认该化合物是否有DNA损伤防护能力。Foci水平代表着正在进行的NHEJ修复，因此，foci水平与DSB程度存在间接关系。而中性彗星实验作为DSB的金标准，虽然步骤较为繁复，但彗星尾长等指标与DSB程度存在直接关系。若用中性彗星实验确证了化合物预处理能降低DSB，那么该化合物可能有抗DNA损伤潜力；进一步收集多个时间点的彗星实验数据，观察DSB-时间曲线，则能确认化合物是抑制了DSB的产生还是促进了DSB修复的加快。
该方案可用于定量评估基于NHEJ修复途径的DNA损伤，但无法评估可能存在的基于HR修复途径的DNA损伤，可另外通过观察Rad51 foci来评估基于HR修复途径的DNA损伤。
该方案采用高内涵成像系统自带的分析软件进行foci的识别和计数，分析较为方便，而且可以实现边拍摄边分析，节省时间。但同时也存在着以下弊端：(1)在导出数据时，只能输出Granule count的值，无法单独输出Granules on nuclei和Granules outside nuclei的值，当背景噪声过大时，会识别到我们所不期望的Granules outside nuclei，使总体的Granule count比实际值偏高。(2)有些细胞观察不到绿色荧光，这些细胞不能给出53BP1的分布信息，所以应该被排除在统计之外，但是软件难以实现排除这些细胞的功能。因此在实验中，尽量使用传代次数<10的细胞，避免EGFP-53BP1的丢失；在拍摄时，注意调节曝光时间，以达到最佳的图片信噪比，减少背景噪声的干扰。

溶液配方

1. 高糖DMEM完全培养基
   89%（v/v）高糖DMEM基础培养基+10%（v/v）胎牛血清+1%（v/v）双抗，保存于4 °C，2周内使用完毕。
2. 嘌呤霉素盐酸盐溶液
   用去离子水配制为10 mg/ml的储备液，用0.22 μm微孔滤膜过滤后，分装，-20 °C可储存1个月。
3. WR-1065盐酸盐溶液
   用去离子水配制为400 mM的储备液，用0.22 μm微孔滤膜过滤后，分装，-20 °C可储存1个月。
4. 待测化合物溶液
   用DMSO配制为100 mM的储备液，分装，-80 °C可储存6个月。
5. PBS溶液
   按试剂说明书，取1袋PBS缓冲液干粉，加去离子水定容到2 L，完全溶解后使用，室温下可储存2周。本方案中，细胞固定染色过程涉及到的PBS均为该PBS溶液。
6. Hoechst 33342溶液
   避光配制、储存、使用。用去离子水配制为10 mg/ml的储备液，分装，4 °C可储存6个月。临用时用PBS稀释成1 μg/ml的工作液。
   

致谢

实验方案改编自Chen et al., (2020)。感谢浙江大学药物信息学研究所-Molecular Devices高内涵成像联合实验室的设备支持。该项目受国家自然科学基金 (项目编号81822047)的支持资助，感谢国家中医药管理局“组分中药与智能制造”多学科交叉团队的支持。

参考文献

1. Mah, L.J., El-Osta, A. and Karagiannis. T.C. (2014). gammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair. Leukemia 24(4): 679-686.
2. Lee, W.H. (2016). DNA damage-associated biomarkers in studying individual sensitivity to low-dose radiation from cardiovascular imaging. Eur Heart J 37(40): 3075-3080.
3. Markova, E. (2005). Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environm Health Perspect 113(9): 1172-1177.
4. Armand, L. (2016). Long-term exposure of A549 cells to titanium dioxide nanoparticles induces DNA damage and sensitizes cells towards genotoxic agents. Nanotoxicology 10(7): 913-923.
5. Qvarnstrom, O.F. (2004). DNA double strand break quantification in skin biopsies. Radiother Oncol 72(3): 311-317.
6. Rothkamm, K. (2015). DNA damage foci: Meaning and significance. Environ Mol Mutagen 56(6): 491-504.
7. Panier, S. and Boulton. S.J. (2014). Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol 15(1): 7-18.
8. Hofer, M. (2016). Two New Faces of Amifostine: Protector from DNA Damage in Normal Cells and Inhibitor of DNA Repair in Cancer Cells. J Med Chem 59(7): 3003-3017.
9. Chen, X., Xun, D., Zheng, R., Zhao, L., Wang, Y. (2020). Deep-learning-assisted assessment of dna damage based on foci images and its application in high-content screening of lead compounds. Anal Chem 92(20): 14267-14277.