Screening for Cell Cycle Regulators-FUCCI Live Cells Labeling Method   

材料与试剂

1. 6 cm dish (NEST, catalog number: 700501)
2. 96孔板 (Nunc, catalog number: 167008)
3. 384孔黑边底透板 (Corning, catalog number: 3764)
4. 胰酶 (GEBICO, catalog number: 25200072)
5. 胎牛血清 (Gemini, catalog number: 900-108)
6. DMEM培养基 (Hyclone, catalog number: SH3002201)
7. DMSO (MP，catalog number: 0219605580)
8. Hoechst33342 (Invitrogen, catalog number: 1985413)
9. 16%多聚甲醛 (Alfa Aesar, catalog number: #43368)
10. siCDK1 序列：ACUUCGUCAUCCAAAUAUA (Genepharma)
11. RISC-free siRNA (Dharmacon, catalog number: #D-001220-01-05)
12. ON-TARGETplus Non-targeting Pool siRNA序列：
    UGGUUUACAUGUCGACUAA, UGGUUUACAUGUUGUGUGA, UGGUUUACAUGUUUUCUGA, UGGUUUACAUGUUUUCCUA
13. DharmaFECT1 (Dharmacon, catalog number: T-2001-03)
14. 5x siRNA buffer (Dharmacon, catalog number: B-002000-UB)
15. RNase-free Water (Qiagen, catalog number: 129117)
    

仪器设备

1. 流式分选仪 (BD, Aria II)
2. 流式检测仪 (BD, LSR II)
3. 自动化分液仪 (Thermo Fisher, Multidrop Combi)
4. 洗板机 (BioTek, ELx405 Select Deep Well Microplate Washer)
5. 高内涵细胞分析仪 (PerkinElmer, Operetta)
   

实验步骤

一、单克隆FUCCI稳转株的构建

1. 将mKO2-hCdt1和mAG-hGem的DNA片段亚克隆至pCDH-CMV-MCS-puro载体上，利用构建好的载体包装慢病毒 (见注意事项1，2)。
2. 将上述两种包装好的病毒同时感染Hela细胞，感染6 h。
3. 48 h后将感染过的Hela细胞用胰酶消化，中止消化，200 × g离心2 min，PBS清洗一遍后，用预冷的DMEM培养基重悬。
4. 通过Aria II进行细胞分选，分选出mKO2阳性的细胞。 (见注意事项3)。
5. 步骤4中的细胞继续培养48 h，重复步骤3，通过流式分选仪分选出mAG阳性的细胞，并将筛选模式调为单细胞分选模式，将GFP阳性的细胞分选于5个预先装有200 μl DMEM完全培养基的96孔板中 (见注意事项4，5)。
6. 将分好的每孔含有单个细胞的96孔板培养10-14 天左右；显微镜下观察单克隆细胞株生长情况，将细胞形态正常，具有明显细胞群落特点的单克隆细胞株传代，扩增至6 cm dish中 (见注意事项6)。
7. 分别取2 x 10⁵个单克隆细胞和野生型Hela细胞铺于6 cm dish，培养36 h，加入Hoechst33342至终浓度为10 μg/mL，37 °C孵育20 min，消化收集细胞。用流式检测仪检测单克隆细胞的Hoechst/mKO2/mAG的信号，根据mKO2/mAG荧光的分布，hoechst33342信号指示的细胞周期分布挑选出最适合用来筛选的单克隆细胞株 (见注意事项7，8)。
   
   

二、单克隆FUCCI稳转株的构建二、siRNA文库转染
经转染优化实验，确定最适转染条件为：在384孔板中，使用DharmaFECT1 0.05 μl/孔，细胞接种密度 650个/孔，转染72 h后进行表型检测 (见注意事项9)。

        siRNA转染的具体操作步骤如下：

1. 阴阳性对照siRNA的制备：
   
   1.1

   使用1x siRNA buffer 分别稀释RISC-free siRNA 和Non-targeting Pool siRNA以及siCDK1 (阳性对照) 至0.1 μM。
   1.2

   将阴阳性siRNA按照图1 (384孔板排布表) 方式加入对应孔内，每孔10 μl (见注意事项10)。
   
   
   图1. 384孔板排步表
   
   
2. 转染试剂的制备：
   
   2.1

   用Opti-MEM按照体积比1:200稀释DharmaFECT1。
   2.2

   使用自动化分液仪 Multidrop Combi将上述转染试剂溶液加入含有siRNA孔内，10 μL /孔。
   2.3

   水平离心机200 × g离心，2 min，将siRNA与转染试剂混匀。
   2.4

   室温静置20 min。
3. 细胞悬液的制备：
   
   3.1

   将单克隆FUCCI稳转株细胞配制成浓度为650个细胞/30 μl DMEM完全培养基的悬液。
   3.2

   使用Multidrop将上述细胞悬液加入siRNA板 (30 μl/孔)。
   3.3

   为减少边缘效应，在384孔板最外围的孔内加入50 μl PBS。
   3.4

   将加好转染试剂和细胞的384板经水平离心机中200 × g离心2 min，放置于细胞培养箱中培养72 h。
   
   

三、筛选实验

1. 用DMEM完全培养基配制浓度为100 μg/mL的Hoechst33342溶液，用Multidrop将Hoechst33342染液加入板中，5 μl/孔。
2. 200 × g离心2 min，置于培养箱中孵育30 min。
3. 用Multidrop将16%多聚甲醛加入板中，12.5 μl/孔；200 × g离心2 min，室温固定孔板内细胞30 min (见注意事项11)。
4. 用FLx405洗板机将384孔板内的液体更换成PBS溶液 (见注意事项12，13)。
5. 用高内涵细胞分析仪Operetta拍摄细胞图像。
   

四、结果与分析

图像拍摄：
Operetta的355/488/561 nm激光器分别对应Hoechst/mAG/mKO2的三种荧光信号，使用10倍物镜拍摄，见图2。


图2. Operetta拍摄结果示例图

图像分析：

1. 根据Hoechst信号的强度和面积设定条件遴选出视野中所有符合标准的细胞核。
2. 在选择出的细胞核区域中，计算去背景后每个细胞核区域内mKO2和mAG信号值 (见注意事项14)。
3. 根据前期实验条件摸索过程中确定细胞周期各个阶段，如G1期，S期等阶段的mAG/mKO2的荧光强度比值范围，计算出孔内G1期细胞所占百分比。如本方法中采取的G1期细胞判定标准为mAG/mKO2小于等于2。 (见注意事项15)。
4. 计算出每个基因的Z-score，p值以及FDR值 (见 Goktug et al., 2013)，并根据最终分析结果的排名挑选出潜在的细胞周期调控因子。
   
   

五、注意事项

1. FUCCI体系中的mKO2荧光蛋白与RFP类似，mAG荧光蛋白与GFP类似，大部分情况下可以用RFP/GFP通道来收集mKO2/mAG的信号。
2. 待分选的细胞置于冰上有利于保持活力，提高单克隆成活率。
3. 分好的96孔板迅速置于冰上，可以提高分选出的单个Hela细胞形成单克隆的成功率。
4. 96孔板的最外围一圈边孔由于边缘效应不建议使用，本方法中分选只用了96孔板中间60个孔。
5. 单克隆细胞位于96孔板培养过程中，推荐每隔5-7 d更换150 μl完全培养基，具体时间视蒸发速度而定。
6. 分选出符合要求的单克隆稳转株应及早冻存，防止传代次数过多导致的荧光比例变化。
7. 单克隆细胞株的筛选标准详情请见Sakaue-Sawano et al. (2008)。
8. 转染过程需要优化的条件有转染试剂的种类，转染试剂的用量，孔内细胞数量，确定最终检测的时间点等。
   
9. 通常情况下，由于实验安排的限制，一般分好siRNA的384孔板都放于-80 °C冰箱保存，待正式筛选实验开始时，提前拿出恢复至室温。
10. 高浓度多聚甲醛会释放甲醛，请在通风橱内进行操作。
11. 孔板内的DMEM培养基会使背景升高，用PBS溶液可以降低背景。
12. 不同的洗板机由于洗板原理不同，可能会造成孔内细胞脱落，需要提前优化洗板流程。
13. 在前期进行的预实验中，需要优化曝光时间，以获得最佳的信噪比。
14. 预实验要对FUCCI细胞株进行多种细胞周期同步化处理，获取细胞周期各个阶段细胞，据此计算出各个周期mAG/mKO2荧光比值范围。
    

溶液配方

1. PBS :

1.06 mM             KH₂PO₄                           0.144 g/L
155.17 mM         NaCl                                9 g/L
2.97 mM             Na₂HPO_4·12H₂O           1.064 g/L
用HCI调节pH至7.4，高温高压灭菌。

2. 1× siRNA buffer

5× siRNA buffer与RNase-free Water (Qiagen, 129117) 体积比1:4混合。

3. DMEM完全培养基

胎牛血清与DMEM培养基以1:9比例混合

4. 细胞冻存液

DMSO和DMEM完全培养基以1:9比例混合，冻存细胞前新鲜配制。

致谢

本项目得到中科院生化与细胞所基金的支持。感谢中科院生化与细胞所化学生物学技术平台在高通量siRNA文库筛选及高内涵成像分析实验中给予的帮助，感谢细胞分析技术平台在流式细胞实验中给予的帮助。

参考文献

1. Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S., Fukami, K., Miyata, T., Miyoshi, H., Imamura, T., Ogawa, M., Masai, H. and Miyawaki, A. (2008). Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell 132: 487-498.
2. Goktug, A. N., Chai, S. C. and Chen, T. (2013). Chapter7: Data analysis approaches in high throughput screening. Drug Discovery. IntechOpen.