The Locating and Quantitative Analysis of Proteins in Mouse Oocytes and Early Embryos via High Content Imaging Analysis System   

试剂与材料

1. Glycine (Sigma, catalog number: G8898)
2. 口吸管 (Sigma, catalog number: A5177)
3. 3.5 cm Petri Dishes (Corning, catalog number: 351008)
4. 96 Well Round (U) Bottom Plate, TC Surface (Thermo Scientific, catalog number: 163320)
5. CellCarrier-96 Ultra Microplates (PerkinElmer, catalog number: 6055302)
6. 2-6月龄雄鼠
7. 6~8周龄雌鼠
8. MEM Alpha (Gibco, catalog number: 32571-036)
9. Sodium Pyruvate (100 mM) (Gibco, catalog number: 11360-070)
10. EDTA (Amresco, catalog number: 0322)
11. BSA (Lablead, catalog number: 0332)
12. NaCl (Sigma, catalog number: S5886)
13. KCl (Sigma, catalog number: P5405)
14. Na₂HPO₄ (Sigma, catalog number: S5136)
15. KH₂PO₄ (Sigma, catalog number: P5655)
16. MgSO₄·7H₂O (Sigma, catalog number: M1880)
17. Na lactate 60% syrup (ml/liter) (Sigma, catalog number: L1375)
18. NaHCO₃ (Sigma, catalog number: S5761)
19. CaCl₂·2H₂O (Sigma, catalog number: C7902)
20. Penicillin-Streptomycin Solution 100x (BBI, catalog number: H225FA0001)
21. 非必需氨基酸, NEAA 100× (Gibco, catalog number: 11140050)
22. 必需氨基酸，EAA 50× (Gibco, catalog number: 11130051)
23. Mineral Oil (Sigma, catalog number: M8410)
24. Poly (vinyl alcohol), PVP (Sigma, catalog number: P8136)
    
25. DAPI (Beyotime, catalog number: C1002)
26. Anti-Dnmt1 Rabbit polyclonal antibody (以mDnmt1 (700-1076aa) 肽段为抗原制备)
27. Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG (H + L) (Beyotime, catalog number: A0423)
28. Modified MEM (MMEM) (见溶液配方)
29. KSOM (见溶液配方)
30. KSOM-AA (见溶液配方)
31. 4%多聚甲醛固定液 (见溶液配方)
32. 10× DPBS (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 二氧化碳细胞培养箱
2. 体式显微镜 (Olympus, model: SZ61)
3. 高内涵成像分析筛选系统 (PerkinElmer, model: Opera Phenix)
   

实验步骤

一、通过体外受精收集不同时期小鼠早期胚胎

1. 准备培养基
   准备四个3.5 cm Petri Dish，分别为：Sperm Dish：1 ml MMEM培养；Oocyte Dish：500 μl MMEM培养基；Fertilization Dish：250 μl MMEM；Wash Dish：4个30-50 μl KSOM-AA培养基液滴；Culture Dish：4个KSOM-AA培养基30-50 μl液滴。所有的培养基需要矿物油液封，置于37 °C，5% CO₂培养箱中平衡至少6小时。
   
2. 精子准备
   2.1

   准备一只有过繁育经验的2-6月龄的雄鼠，在雌鼠注射完hCG后12-13小时牺牲。
   2.2

   立即分离附睾和输精管，置于平衡好的Sperm Dish中，使用1 ml注射器针头穿刺附睾，释放精子。
   2.3

   精子获能。将Sperm Dish放入37 °C，5% CO₂培养箱中1小时。
   注：获能后的精子浓度以1 x 10⁶-2.5 x 10⁶ /ml为宜。
   
3. 卵细胞准备
   3.1

   取6~8周龄的雌鼠注射PMSG，48小时后注射hCG，13小时后牺牲雌鼠，迅速分离输卵管后置于平衡好的Oocyte Dish中。
   3.2

   使用1 ml注射器针头剥离输卵管中包含MII卵细胞的积云细胞团，转移至Fertilization Dish。
4. 体外受精。加入10-20 μl获能后的精子至Fertilization Dish，培养4-6小时。
   注：需根据实际情况调整精子量，过少会导致受精效率低，过多会出现多精入卵现象。
   
5. 持续培养。将受精后的卵细胞/受精卵移至Wash Dish的液滴中，去除游离的精子和细胞碎片，然后转移至Culture Dish持续培养。
6. 收集不同发育阶段的早期胚胎，用含有3% PVP的DPBS洗2次后，准备染色。从体外受精 (步骤4) 开始计算受发育时间，受精卵：8-12小时；2细胞：19-36小时；4细胞：42-44小时；8细胞：56-58小时；16细胞：64-66小时；囊胚：74小时后。

二、免疫荧光染色

使用口吸管将收集到的胚胎移入96孔U底板中进行染色，所有更换试剂的步骤均为使用口吸管将胚胎从前一步的试剂中移出后放入新试剂。

1. 加入100 μl 4% PFA在室温固定15 min。
2. 加入100 ul包含0.1 M Glycine的DPBS洗三次。
3. 加入包含0.5% Triton X-100和1% BSA的DPBS在室温通透15 min。
   注：由于染色过程中，早期胚胎为游离状态，不同溶液密度变化使其四散漂浮，容易遗漏样品，因此建议此后所有溶液通过包含1% BSA维持密度一致性。
4. 加入100 μl包含0.1% Triton X-100和1% BSA的DPBS封闭液，室温封闭1小时或4 °C过夜。
5. 将Rabbit anti-DNMT1抗体按1：500稀释于封闭液，按每孔50 μl加入，室温孵育2小时或4 °C过夜。
6. 加入100 μl封闭液洗三次。
7. 将Donkey anti-Mouse 488抗体用封闭液按1：1000稀释，按每孔50 μl加入，室温孵育2小时或4 °C过夜。
8. 加入100 μl封闭液洗三次。
9. 按照1：1000稀释1 mg/ml DAPI 50 μl染色15 min。
10. 将胚胎移入100 μl 包含10%甘油的DPBS的96 PerlinElmer CellCarrrier板中，加入适量矿物油液封。样品可于4 °C保存数月。
    

三、高内涵成像

1. 启动仪器，打开Harmony软件，将96孔板用擦镜纸擦拭板底后，放入高内涵仪器中等待成像。
2. 根据所用96孔板型号选择“Plate Type”，使用5x物镜。
3. 设置拍摄参数（图1）。根据需要在“Channel Selection”设置不同荧光通道（图1A,绿色：Alexa 488，Ex488/Em500-550；蓝色：DAPI，Ex405/Em435-480) 。在“Layout Selection”中选择视野数（Number of Fields），勾选“Use in Test”后，点击上方“Test”进行预拍摄（图1B）。根据荧光强度调整合适曝光时间和激发光强度后保存文件为“embryo 5×”。
   注：可通过“Channel Sequence”选择不同荧光通道拍摄顺序，避免可能的串色。
   注：由于早期胚胎细胞较大 (超过70 μm)，可直接使用默认高度参数进行拍摄。
4. 编写目标搜索程序，程序编写及说明见表1，保存为“Find”。
5. 添加Find文件至“embryo 5×”的Online Jobs，保存文件。
6. 以步骤3预拍摄结果设置为孔背景，转换63x水镜，选取合适视野，根据荧光强度调整曝光时间，激发光强度，设置堆叠层数和距离进行实验预拍摄。参数调整完毕后保存文件为“embryo 63×”。
   注：设置孔背景方式为进入导航栏 (Navigation) Images界面，在Well模块单击鼠标右键选择“Background for Well”。
7. 使用PreciScan模式成像，依次加载文件“embryo 5×”和“embryo 63×”后运行。
   注：正式拍摄前建议取出96孔板，擦拭步骤6使用水镜后的液体残余，避免对后续拍摄对焦产生影响。
8. 使用Harmony 软件进行分析计算，计算流程及说明见表2及图2。
9. 结果导出。依次选择Setting→Data Management→Export Data，按照需求选择合适的格式导出分析数据。
   
   
   图 1. 拍摄参数设置
   
   表 1 ：目标搜索程序设置
   
   
   
   图 2. 通过目标搜索程序搜索拍摄对象
   
   表 2 ：成像结果计算设置
   
   
   
   图 3. 早期胚胎细胞的三维重构。A，受精卵；B，2细胞胚胎；C，4细胞胚胎；D，8细胞胚胎。
   
   

溶液配方

1. Modified MEM (MMEM)
   
   表 3. Modified MEM (MMEM)
   
   
   配置完成后使用0.22 μl滤头过滤，分装于-80 °C保存，可在4 °C保存一周。
   
2. KSOM（表4）
   
   表 4. KSOM
   
   
   配置完成后使用0.22 μl滤头过滤，分装于-80 °C保存，可在4 °C保存一周。
   
3. KSOM-AA
   每100 ml KSOM培养基补充0.5ml NEAA和1ml EAA即可，可在4 °C保存一周。
   
4. 4%多聚甲醛 (4% PFA)
   称取2 g多聚甲醛粉末至50 ml离心管中，加入40 ml ddH₂O及200 μl 0.2 M NaOH，60-70 °C水浴至完全溶解 (约30-60分钟)，加入5 ml 10x DPBS，调整pH值为7.8后定容至50 ml。可于4 °C避光保存2个月。
   
5. 10× DPBS
   称取80 g NaCl，0.2 g KCl，1.42 g Na₂HPO₄，0.27 g KH2PO4溶于800 ml去离子水，用浓盐酸将pH值调节至7.4后用去离子水定容至1 L。高温高压灭菌后室温保存。
   

致谢

中国科学院特别研究助理资助项目 (2019)。

参考文献

1. A. 纳吉，M. 格斯滕斯坦，K. 文特斯滕，R. 贝林杰. (2004) 小鼠胚胎操作实验指南（影印版）. 北京：科学出版社.

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