Free Cholesterol Labeling and Quantification   

材料与试剂

1. 96 Well Black Assay Plate, Clear Bottom with Lid, 3603（Corning Costar, Cambridge, MA, 货号：04119005）
2. Huh7细胞（ATCC, USA）
3. DMEM/HIGH GLUCOSE 培养基（HyClone, 货号：SH30243.01）
4. Filipin（Dalian Meilun Biotech，货号：MB1848），粉末-20 °C避光防潮密闭干燥保存一年
5. HCS NuclearMask^TM Red stain（Invitrogen，货号：H10326），-20 °C避光可稳定保存一年；
6. DMSO （sigma, 货号：D4540-1L）
7. U-18666A（Cayman，Item No.10009869），-20 °C可稳定保存两年以上
8. 4%多聚甲醛固定液（Sangon Biotech，货号：E672002），-20 °C保存
9. 棕榈酸钠（Sodium palmitate）（Sigma-Aldrich，货号：P 9767），2-8 °C保存
10. 牛血清白蛋白，无脂肪酸（BSA，Fatty Acid Free）（Yeasen Biotech，货号：36104ES25），4 °C密封可稳定保存五年以上
11. Penicillin/Streptomycin（Gibco, Germany，货号：15240-062）
12. Filipin储备液（见溶液配方）
13. Filipin工作液（见溶液配方）
14. HCS NuclearMask^TM Red工作液（见溶液配方）
15. 10% BSA溶液（见溶液配方）
16. 10 mM PA储备液（见溶液配方）
17. DMEM/HIGH GLUCOSE完全培养基 （见溶液配方）
    

仪器设备

1. Operetta CLSTM高内涵成像分析系统（PerkinElmer）
2. 移液枪（Eppendorf）
   

实验步骤

1. 细胞铺板：采用96孔底透黑色细胞培养板，Huh7细胞，5 x 10³个/孔，放置于37 °C培养箱中培养。
2. 药物处理：细胞贴壁24 h后，根据实验需求对细胞进行不同的处理。本实验中通过0.5 mM饱和脂肪酸棕榈酸（Palmitic acid, PA）处理细胞24 h，目的是引起细胞内游离胆固醇的蓄积。同时用DMSO和U-18666A（细胞内胆固醇转运抑制剂）(Koh and Cheung, 2006) 处理细胞24 h，DMSO作为阴性对照，U-18666A作为阳性对照。具体处理条件如下：
   （1）Control组：完全DMEM稀释等体积的9% BSA作为对照；
   （2）PA组：完全DMEM培养基稀释10 mM PA 储备液至终浓度为0.5 mM PA；
   （3）完全DMEM培养基加入0.1% DMSO；
   （4）完全DMEM培养基稀释U-18666A至终浓度为1.25 μM；
   取出96孔板，吸去培养基，分别加入上述配置好的培养基（各3复孔），放回37 °C培养箱中继续培养24 h。
   
3. 固定及染色：
   （1）除去培养基，用4%多聚甲醛，室温固定细胞30 min；
   （2）Filipin染色：去除4%多聚甲醛，PBS洗三次后，每孔加100 μL Filipin工作液，避光室温孵育30 min；
   （3）HCS NuclearMask^TM Red染色：去除Filipin工作液，避光条件下PBS洗三次后，每孔加100 μL HCS NuclearMask^TM Red工作液，避光室温孵育10 min；
   （4）去除染色液，避光条件下PBS洗三次，最后每孔加100 μL PBS，进行后续的荧光拍照和分析。
   
4. 高内涵成像
   （1）打开Operetta主机，采用Harmony4.9 软件进行拍摄和统计。将96孔板放入仪器中，设置图像采集条件，包括细胞培养板的品牌规格和物镜倍数（孔板型号为3603 Corning，物镜倍镜设为20×，常用于高内涵筛选），添加所需的荧光通道（Filipin：360-400 nm激发光和410-480 nm发射光， HCS NuclearMask^TM Red：620-640 nm激发光和650-760 nm发射光）；
   （2）分别调整两个荧光通道的参数，包括time（曝光时间），power（光源强度）及height（聚焦高度），确定最佳曝光时间、光源强度和聚焦高度，并保存该拍摄条件；
   （3）选择要拍摄的孔和视野（一般选择10个视野），点击Run Experiment进行图像采集；
   （4）拍摄完成后，点击Image Analysis进行图像分析，依次点击Find Nuclei，Find cytoplasm，即为该视野的细胞数和胞质区域，然后点击Calculate intensity properties选择计算平均荧光强度，范围设为细胞质，并保存该分析方法；
   （5）点击Evaluation，使用已保存的分析方法进行多孔分析；
   （6）接着，点击Data management导出数据；
   （7）返回Image Analysis图像分析部分，找到每个视野的图像，点击鼠标右键，选择Save Image as保存该视野的图像（分别保存每个单荧光通道和Merge的图像）。
   

结果与分析

图 1. 不同条件处理 Huh7 细胞之后细胞内游离胆固醇的含量。A. PA和U-18666A分别处理24h之后，用Filipin和HCS NuclearMask^TM染色和Operetta高内涵荧光成像。B：荧光统计分析结果。^***P<0.001 vs control或者 DMSO，数据用mean ± SEM表示.

如图1A所示，U-18666A处理之后，Filipin荧光强度增加，表明细胞内胆固醇的含量上升。同时，与control相比，0.5 mM PA处理24 h之后Filipin荧光强度也显著增加，达到阳性对照的效果，表明我们选择的处理条件的确可以引起细胞内胆固醇的蓄积。Operetta高内涵成像分析系统统计分析与荧光结果一致（图1B）。
目前用于检测细胞内FC的方法主要包括酶促试剂盒检测和液质联用（LC-MS）。其中，试剂盒价格昂贵，检测限较高，对于细胞数较少或者细胞中FC轻微的变化很难准确又灵敏的被定量。而LC-MS的方法，对于样品的精度要求很高，样品前处理过程复杂，引入的系统误差较多，再加上整个检测时程较长，仪器昂贵。相比较而言，Filipin染色定量的方法，操作简单，结果可视化，性价比高，更适用于高通量的筛选。

失败经验

1. Filipin染料对光特别敏感，因此保存的时候需要避光，并且避免反复冻融，储备液需要分装冻存。同时，染色之后的细胞需要立即进行拍照分析以避免荧光的淬灭。
2. 观察分析Filipin荧光的最佳激发光是340-380 nm激发光和385-470 nm发射光，观察HCS NuclearMask^TM Red荧光的最佳激发光是622 nm激发光和645 nm发射光。
3. 不同细胞的生长速率不同，铺板的时候要控制好细胞密度，避免因为细胞过密而引起的Operetta高内涵成像分析系统统计分析结果不准确。
4. 因为需要根据HCS NuclearMask^TM Red染色的结果来判定细胞的定位和数量，用以校正每个细胞的平均Filipin荧光强度，所以本实验中推荐使用单层贴壁细胞。
5. 不同细胞对PA处理的响应不同，因此更改细胞系使用该处理条件时，需要摸索合适的时间和浓度。
   

溶液配方

1. Filipin储备液
   5 mg的Filipin粉末溶于200 μL DMSO，得到25 mg/mL的Filipin储备液，-80 °C避光分装保存，避免反复冻融。
   
2. Filipin工作液
   PBS稀释Filipin储备液至终浓度为0.05 mg/mL，得到Filipin工作液，避光保存，现配现用。
   
3. HCS NuclearMask^TM Red工作液
   取10 μL HCS NuclearMask^TM Red加入10 mL的PBS溶液中，得到HCS NuclearMask^TM Red工作液，避光保存，现配现用。
   
4. 10% BSA溶液
   称取1 g BSA（Fatty Acid Free）溶解于10 mL PBS中，过0.22 μm滤膜即可得到10% BSA溶液。
   
5. 10 mM PA储备液
   称取27.841 mg的棕榈酸钠（Sodium palmitate），加入1 mL PBS中，70 °C加热溶解得到100 mM 的原液，之后与9 mL 10% BSA溶液混合，55 °C加热至溶液澄清，即可得到10 mM PA储备液。-20 °C分装保存，使用时用培养基稀释至所需浓度。
   
6. DMEM/HIGH GLUCOSE完全培养基
   DMEM/HIGH GLUCOSE培养基450 mL+FBS 50 mL+Penicillin/Streptomycin 5 mL。
   

致谢

基金项目（Foundation）: 国家科技部“重大新药创制”科技重大专项（No 2018ZX09101001-003-007）。

参考文献

1. Koh, C. H. and Cheung, N. S. (2006). Cellular mechanism of U18666A-mediated apoptosis in cultured murine cortical neurons: bridging Niemann-Pick disease type C and Alzheimer's disease. Cell Signal 18(11): 1844-1853. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16797161
2. Luo, J., Yang, H. and Song, B. L. (2020). Mechanisms and regulation of cholesterol homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol 21(4): 225-245.
3. Maxfield, F. R. and Wustner, D. (2012). Analysis of cholesterol trafficking with fluorescent probes. Methods Cell Biol 108: 367-393.
4. Wilhelm, L. P., Voilquin, L., Kobayashi, T., Tomasetto, C. and Alpy, F. (2019). Intracellular and Plasma Membrane Cholesterol Labeling and Quantification Using Filipin and GFP-D4. Methods Mol Biol 1949: 137-152.