Navigate this Article


 

Free Cholesterol Labeling and Quantification   

How to cite Favorites Q&A Share your feedback Cited by

摘要:胆固醇,又称胆甾醇,是动物组织细胞不可缺少的重要物质(Luo et al., 2020)。胆固醇是生物膜的主要成分,在细胞器之间快速运输且分布不均。细胞内胆固醇分布异常是许多溶酶体脂质储存障碍的标志,因此细胞胆固醇可视化和成像,包括质膜和细胞内部,对于研究胆固醇的含量和分布至关重要(Wilhelm et al., 2019)。菲律宾菌素(filipin,filimarisin)是从菲律宾链霉菌(Streptomyces filipinensis)培养物中分离得到的混合物的统称,其主要成分是FilipinIII,是一种28元环戊烯大环内酯类抗生素,可以特异的与游离的胆固醇相互作用而不与酯化的胆固醇结合。FilipinIII结合游离的胆固醇后,激发光谱波峰约在360 nm处,发射光谱波峰约在480nm处,通过检测激发波长360 nm和发射波长480 nm附近的荧光信号来表征细胞内的胆固醇含量,已被广泛应用于细胞中胆固醇的定位和定量(Maxfield and Wustner, 2012)。在进行高通量细胞内游离胆固醇的定量时,采用HCS NuclearMaskTM Red核染料,它是一种可以应用于活细胞和固定细胞标记细胞核的探针,并且可以避免甲醛固定或者表面活性剂通透时带来的影响,在实验中可以做为内参表征细胞数。本实验中,细胞在经过不同的处理之后,对细胞进行FilipinIII和HCS NuclearMaskTM Red染色,通过基于图像的高内涵筛选(high content screening, HCS)分析评价影响细胞内游离胆固醇含量和分布的处理条件。

关键词: 胆固醇, FilipinIII染色, HCS NuclearMaskTM Red染色, 高内涵筛选

材料与试剂

  1. 96 Well Black Assay Plate, Clear Bottom with Lid, 3603(Corning Costar, Cambridge, MA, 货号:04119005)
  2. Huh7细胞(ATCC, USA)
  3. DMEM/HIGH GLUCOSE 培养基(HyClone, 货号:SH30243.01)
  4. Filipin(Dalian Meilun Biotech,货号:MB1848),粉末-20 °C避光防潮密闭干燥保存一年
  5. HCS NuclearMaskTM Red stain(Invitrogen,货号:H10326),-20 °C避光可稳定保存一年;
  6. DMSO (sigma, 货号:D4540-1L)
  7. U-18666A(Cayman,Item No.10009869),-20 °C可稳定保存两年以上
  8. 4%多聚甲醛固定液(Sangon Biotech,货号:E672002),-20 °C保存
  9. 棕榈酸钠(Sodium palmitate)(Sigma-Aldrich,货号:P 9767),2-8 °C保存
  10. 牛血清白蛋白,无脂肪酸(BSA,Fatty Acid Free)(Yeasen Biotech,货号:36104ES25),4 °C密封可稳定保存五年以上
  11. Penicillin/Streptomycin(Gibco, Germany,货号:15240-062)
  12. Filipin储备液(见溶液配方)
  13. Filipin工作液(见溶液配方)
  14. HCS NuclearMaskTM Red工作液(见溶液配方)
  15. 10% BSA溶液(见溶液配方)
  16. 10 mM PA储备液(见溶液配方)
  17. DMEM/HIGH GLUCOSE完全培养基 (见溶液配方)

仪器设备

  1. Operetta CLSTM高内涵成像分析系统(PerkinElmer)
  2. 移液枪(Eppendorf)

实验步骤

  1. 细胞铺板:采用96孔底透黑色细胞培养板,Huh7细胞,5 x 103个/孔,放置于37 °C培养箱中培养。
  2. 药物处理:细胞贴壁24 h后,根据实验需求对细胞进行不同的处理。本实验中通过0.5 mM饱和脂肪酸棕榈酸(Palmitic acid, PA)处理细胞24 h,目的是引起细胞内游离胆固醇的蓄积。同时用DMSO和U-18666A(细胞内胆固醇转运抑制剂)(Koh and Cheung, 2006) 处理细胞24 h,DMSO作为阴性对照,U-18666A作为阳性对照。具体处理条件如下:
    (1)Control组:完全DMEM稀释等体积的9% BSA作为对照;
    (2)PA组:完全DMEM培养基稀释10 mM PA 储备液至终浓度为0.5 mM PA;
    (3)完全DMEM培养基加入0.1% DMSO;
    (4)完全DMEM培养基稀释U-18666A至终浓度为1.25 μM;
    取出96孔板,吸去培养基,分别加入上述配置好的培养基(各3复孔),放回37 °C培养箱中继续培养24 h。
  3. 固定及染色:
    (1)除去培养基,用4%多聚甲醛,室温固定细胞30 min;
    (2)Filipin染色:去除4%多聚甲醛,PBS洗三次后,每孔加100 μL Filipin工作液,避光室温孵育30 min;
    (3)HCS NuclearMaskTM Red染色:去除Filipin工作液,避光条件下PBS洗三次后,每孔加100 μL HCS NuclearMaskTM Red工作液,避光室温孵育10 min;
    (4)去除染色液,避光条件下PBS洗三次,最后每孔加100 μL PBS,进行后续的荧光拍照和分析。
  4. 高内涵成像
    (1)打开Operetta主机,采用Harmony4.9 软件进行拍摄和统计。将96孔板放入仪器中,设置图像采集条件,包括细胞培养板的品牌规格和物镜倍数(孔板型号为3603 Corning,物镜倍镜设为20×,常用于高内涵筛选),添加所需的荧光通道(Filipin:360-400 nm激发光和410-480 nm发射光, HCS NuclearMaskTM Red:620-640 nm激发光和650-760 nm发射光);
    (2)分别调整两个荧光通道的参数,包括time(曝光时间),power(光源强度)及height(聚焦高度),确定最佳曝光时间、光源强度和聚焦高度,并保存该拍摄条件;
    (3)选择要拍摄的孔和视野(一般选择10个视野),点击Run Experiment进行图像采集;
    (4)拍摄完成后,点击Image Analysis进行图像分析,依次点击Find Nuclei,Find cytoplasm,即为该视野的细胞数和胞质区域,然后点击Calculate intensity properties选择计算平均荧光强度,范围设为细胞质,并保存该分析方法;
    (5)点击Evaluation,使用已保存的分析方法进行多孔分析;
    (6)接着,点击Data management导出数据;
    (7)返回Image Analysis图像分析部分,找到每个视野的图像,点击鼠标右键,选择Save Image as保存该视野的图像(分别保存每个单荧光通道和Merge的图像)。

结果与分析


图 1. 不同条件处理 Huh7 细胞之后细胞内游离胆固醇的含量。A. PA和U-18666A分别处理24h之后,用Filipin和HCS NuclearMaskTM染色和Operetta高内涵荧光成像。B:荧光统计分析结果。***P<0.001 vs control或者 DMSO,数据用mean ± SEM表示.

如图1A所示,U-18666A处理之后,Filipin荧光强度增加,表明细胞内胆固醇的含量上升。同时,与control相比,0.5 mM PA处理24 h之后Filipin荧光强度也显著增加,达到阳性对照的效果,表明我们选择的处理条件的确可以引起细胞内胆固醇的蓄积。Operetta高内涵成像分析系统统计分析与荧光结果一致(图1B)。
目前用于检测细胞内FC的方法主要包括酶促试剂盒检测和液质联用(LC-MS)。其中,试剂盒价格昂贵,检测限较高,对于细胞数较少或者细胞中FC轻微的变化很难准确又灵敏的被定量。而LC-MS的方法,对于样品的精度要求很高,样品前处理过程复杂,引入的系统误差较多,再加上整个检测时程较长,仪器昂贵。相比较而言,Filipin染色定量的方法,操作简单,结果可视化,性价比高,更适用于高通量的筛选。

失败经验

  1. Filipin染料对光特别敏感,因此保存的时候需要避光,并且避免反复冻融,储备液需要分装冻存。同时,染色之后的细胞需要立即进行拍照分析以避免荧光的淬灭。
  2. 观察分析Filipin荧光的最佳激发光是340-380 nm激发光和385-470 nm发射光,观察HCS NuclearMaskTM Red荧光的最佳激发光是622 nm激发光和645 nm发射光。
  3. 不同细胞的生长速率不同,铺板的时候要控制好细胞密度,避免因为细胞过密而引起的Operetta高内涵成像分析系统统计分析结果不准确。
  4. 因为需要根据HCS NuclearMaskTM Red染色的结果来判定细胞的定位和数量,用以校正每个细胞的平均Filipin荧光强度,所以本实验中推荐使用单层贴壁细胞。
  5. 不同细胞对PA处理的响应不同,因此更改细胞系使用该处理条件时,需要摸索合适的时间和浓度。

溶液配方

  1. Filipin储备液
    5 mg的Filipin粉末溶于200 μL DMSO,得到25 mg/mL的Filipin储备液,-80 °C避光分装保存,避免反复冻融。
  2. Filipin工作液
    PBS稀释Filipin储备液至终浓度为0.05 mg/mL,得到Filipin工作液,避光保存,现配现用。
  3. HCS NuclearMaskTM Red工作液
    取10 μL HCS NuclearMaskTM Red加入10 mL的PBS溶液中,得到HCS NuclearMaskTM Red工作液,避光保存,现配现用。
  4. 10% BSA溶液
    称取1 g BSA(Fatty Acid Free)溶解于10 mL PBS中,过0.22 μm滤膜即可得到10% BSA溶液。
  5. 10 mM PA储备液
    称取27.841 mg的棕榈酸钠(Sodium palmitate),加入1 mL PBS中,70 °C加热溶解得到100 mM 的原液,之后与9 mL 10% BSA溶液混合,55 °C加热至溶液澄清,即可得到10 mM PA储备液。-20 °C分装保存,使用时用培养基稀释至所需浓度。
  6. DMEM/HIGH GLUCOSE完全培养基
    DMEM/HIGH GLUCOSE培养基450 mL+FBS 50 mL+Penicillin/Streptomycin 5 mL。

致谢

基金项目(Foundation): 国家科技部“重大新药创制”科技重大专项(No 2018ZX09101001-003-007)。

参考文献

  1. Koh, C. H. and Cheung, N. S. (2006). Cellular mechanism of U18666A-mediated apoptosis in cultured murine cortical neurons: bridging Niemann-Pick disease type C and Alzheimer's disease. Cell Signal 18(11): 1844-1853. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16797161
  2. Luo, J., Yang, H. and Song, B. L. (2020). Mechanisms and regulation of cholesterol homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol 21(4): 225-245.
  3. Maxfield, F. R. and Wustner, D. (2012). Analysis of cholesterol trafficking with fluorescent probes. Methods Cell Biol 108: 367-393.
  4. Wilhelm, L. P., Voilquin, L., Kobayashi, T., Tomasetto, C. and Alpy, F. (2019). Intracellular and Plasma Membrane Cholesterol Labeling and Quantification Using Filipin and GFP-D4. Methods Mol Biol 1949: 137-152.

Please login or register for free to view full text
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:董云霞, 陈静, 任进. (2021). 细胞内游离胆固醇的标记和定量. Bio-101: e1010832. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010832.
How to cite: Dong, Y. X., Chen, J. and Ren, J. (2021). Free Cholesterol Labeling and Quantification. Bio-101: e1010832. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010832.
Q&A
By submitting a question/comment you agree to abide by our Terms of Service. If you find something abusive or that does not comply with our terms please contact us at eb@bio-protocol.org.

If you have any questions/comments about this protocol, you are highly recommended to post here. We will invite the authors of this protocol as well as some of its users to address your questions/comments. To make it easier for them to help you, you are encouraged to post your data including images for the troubleshooting.

If you have any questions/comments about this protocol, you are highly recommended to post here. We will invite the authors of this protocol as well as some of its users to address your questions/comments. To make it easier for them to help you, you are encouraged to post your data including images for the troubleshooting.

We use cookies on this site to enhance your user experience. By using our website, you are agreeing to allow the storage of cookies on your computer.