摘要:胆固醇,又称胆甾醇,是动物组织细胞不可缺少的重要物质(Luo et al., 2020)。胆固醇是生物膜的主要成分,在细胞器之间快速运输且分布不均。细胞内胆固醇分布异常是许多溶酶体脂质储存障碍的标志,因此细胞胆固醇可视化和成像,包括质膜和细胞内部,对于研究胆固醇的含量和分布至关重要(Wilhelm et al., 2019)。菲律宾菌素(filipin,filimarisin)是从菲律宾链霉菌(Streptomyces filipinensis)培养物中分离得到的混合物的统称,其主要成分是FilipinIII,是一种28元环戊烯大环内酯类抗生素,可以特异的与游离的胆固醇相互作用而不与酯化的胆固醇结合。FilipinIII结合游离的胆固醇后,激发光谱波峰约在360 nm处,发射光谱波峰约在480nm处,通过检测激发波长360 nm和发射波长480 nm附近的荧光信号来表征细胞内的胆固醇含量,已被广泛应用于细胞中胆固醇的定位和定量(Maxfield and Wustner, 2012)。在进行高通量细胞内游离胆固醇的定量时,采用HCS NuclearMaskTM Red核染料,它是一种可以应用于活细胞和固定细胞标记细胞核的探针,并且可以避免甲醛固定或者表面活性剂通透时带来的影响,在实验中可以做为内参表征细胞数。本实验中,细胞在经过不同的处理之后,对细胞进行FilipinIII和HCS NuclearMaskTM Red染色,通过基于图像的高内涵筛选(high content screening, HCS)分析评价影响细胞内游离胆固醇含量和分布的处理条件。
关键词: 胆固醇, FilipinIII染色, HCS NuclearMaskTM Red染色, 高内涵筛选
材料与试剂
- 96 Well Black Assay Plate, Clear Bottom with Lid, 3603(Corning Costar, Cambridge, MA, 货号:04119005)
- Huh7细胞(ATCC, USA)
- DMEM/HIGH GLUCOSE 培养基(HyClone, 货号:SH30243.01)
- Filipin(Dalian Meilun Biotech,货号:MB1848),粉末-20 °C避光防潮密闭干燥保存一年
- HCS NuclearMaskTM Red stain(Invitrogen,货号:H10326),-20 °C避光可稳定保存一年;
- DMSO (sigma, 货号:D4540-1L)
- U-18666A(Cayman,Item No.10009869),-20 °C可稳定保存两年以上
- 4%多聚甲醛固定液(Sangon Biotech,货号:E672002),-20 °C保存
- 棕榈酸钠(Sodium palmitate)(Sigma-Aldrich,货号:P 9767),2-8 °C保存
- 牛血清白蛋白,无脂肪酸(BSA,Fatty Acid Free)(Yeasen Biotech,货号:36104ES25),4 °C密封可稳定保存五年以上
- Penicillin/Streptomycin(Gibco, Germany,货号:15240-062)
- Filipin储备液(见溶液配方)
- Filipin工作液(见溶液配方)
- HCS NuclearMaskTM Red工作液(见溶液配方)
- 10% BSA溶液(见溶液配方)
- 10 mM PA储备液(见溶液配方)
- DMEM/HIGH GLUCOSE完全培养基 (见溶液配方)
仪器设备
- Operetta CLSTM高内涵成像分析系统(PerkinElmer)
- 移液枪(Eppendorf)
实验步骤
- 细胞铺板:采用96孔底透黑色细胞培养板,Huh7细胞,5 x 103个/孔,放置于37 °C培养箱中培养。
- 药物处理:细胞贴壁24 h后,根据实验需求对细胞进行不同的处理。本实验中通过0.5 mM饱和脂肪酸棕榈酸(Palmitic acid, PA)处理细胞24 h,目的是引起细胞内游离胆固醇的蓄积。同时用DMSO和U-18666A(细胞内胆固醇转运抑制剂)(Koh and Cheung, 2006) 处理细胞24 h,DMSO作为阴性对照,U-18666A作为阳性对照。具体处理条件如下:
(1)Control组:完全DMEM稀释等体积的9% BSA作为对照;
(2)PA组:完全DMEM培养基稀释10 mM PA 储备液至终浓度为0.5 mM PA;
(3)完全DMEM培养基加入0.1% DMSO;
(4)完全DMEM培养基稀释U-18666A至终浓度为1.25 μM;
取出96孔板,吸去培养基,分别加入上述配置好的培养基(各3复孔),放回37 °C培养箱中继续培养24 h。
- 固定及染色:
(1)除去培养基,用4%多聚甲醛,室温固定细胞30 min;
(2)Filipin染色:去除4%多聚甲醛,PBS洗三次后,每孔加100 μL Filipin工作液,避光室温孵育30 min;
(3)HCS NuclearMaskTM Red染色:去除Filipin工作液,避光条件下PBS洗三次后,每孔加100 μL HCS NuclearMaskTM Red工作液,避光室温孵育10 min;
(4)去除染色液,避光条件下PBS洗三次,最后每孔加100 μL PBS,进行后续的荧光拍照和分析。
- 高内涵成像
(1)打开Operetta主机,采用Harmony4.9 软件进行拍摄和统计。将96孔板放入仪器中,设置图像采集条件,包括细胞培养板的品牌规格和物镜倍数(孔板型号为3603 Corning,物镜倍镜设为20×,常用于高内涵筛选),添加所需的荧光通道(Filipin:360-400 nm激发光和410-480 nm发射光, HCS NuclearMaskTM Red:620-640 nm激发光和650-760 nm发射光);
(2)分别调整两个荧光通道的参数,包括time(曝光时间),power(光源强度)及height(聚焦高度),确定最佳曝光时间、光源强度和聚焦高度,并保存该拍摄条件;
(3)选择要拍摄的孔和视野(一般选择10个视野),点击Run Experiment进行图像采集;
(4)拍摄完成后,点击Image Analysis进行图像分析,依次点击Find Nuclei,Find cytoplasm,即为该视野的细胞数和胞质区域,然后点击Calculate intensity properties选择计算平均荧光强度,范围设为细胞质,并保存该分析方法;
(5)点击Evaluation,使用已保存的分析方法进行多孔分析;
(6)接着,点击Data management导出数据;
(7)返回Image Analysis图像分析部分,找到每个视野的图像,点击鼠标右键,选择Save Image as保存该视野的图像(分别保存每个单荧光通道和Merge的图像)。
结果与分析
![](https://en-cdn.bio-protocol.org/attached/image/20210701/20210701211410_6875.png)
图 1. 不同条件处理 Huh7 细胞之后细胞内游离胆固醇的含量。A. PA和U-18666A分别处理24h之后,用Filipin和HCS NuclearMaskTM染色和Operetta高内涵荧光成像。B:荧光统计分析结果。***P<0.001 vs control或者 DMSO,数据用mean ± SEM表示.
如图1A所示,U-18666A处理之后,Filipin荧光强度增加,表明细胞内胆固醇的含量上升。同时,与control相比,0.5 mM PA处理24 h之后Filipin荧光强度也显著增加,达到阳性对照的效果,表明我们选择的处理条件的确可以引起细胞内胆固醇的蓄积。Operetta高内涵成像分析系统统计分析与荧光结果一致(图1B)。
目前用于检测细胞内FC的方法主要包括酶促试剂盒检测和液质联用(LC-MS)。其中,试剂盒价格昂贵,检测限较高,对于细胞数较少或者细胞中FC轻微的变化很难准确又灵敏的被定量。而LC-MS的方法,对于样品的精度要求很高,样品前处理过程复杂,引入的系统误差较多,再加上整个检测时程较长,仪器昂贵。相比较而言,Filipin染色定量的方法,操作简单,结果可视化,性价比高,更适用于高通量的筛选。
失败经验
- Filipin染料对光特别敏感,因此保存的时候需要避光,并且避免反复冻融,储备液需要分装冻存。同时,染色之后的细胞需要立即进行拍照分析以避免荧光的淬灭。
- 观察分析Filipin荧光的最佳激发光是340-380 nm激发光和385-470 nm发射光,观察HCS NuclearMaskTM Red荧光的最佳激发光是622 nm激发光和645 nm发射光。
- 不同细胞的生长速率不同,铺板的时候要控制好细胞密度,避免因为细胞过密而引起的Operetta高内涵成像分析系统统计分析结果不准确。
- 因为需要根据HCS NuclearMaskTM Red染色的结果来判定细胞的定位和数量,用以校正每个细胞的平均Filipin荧光强度,所以本实验中推荐使用单层贴壁细胞。
- 不同细胞对PA处理的响应不同,因此更改细胞系使用该处理条件时,需要摸索合适的时间和浓度。
溶液配方
- Filipin储备液
5 mg的Filipin粉末溶于200 μL DMSO,得到25 mg/mL的Filipin储备液,-80 °C避光分装保存,避免反复冻融。
- Filipin工作液
PBS稀释Filipin储备液至终浓度为0.05 mg/mL,得到Filipin工作液,避光保存,现配现用。
- HCS NuclearMaskTM Red工作液
取10 μL HCS NuclearMaskTM Red加入10 mL的PBS溶液中,得到HCS NuclearMaskTM Red工作液,避光保存,现配现用。
- 10% BSA溶液
称取1 g BSA(Fatty Acid Free)溶解于10 mL PBS中,过0.22 μm滤膜即可得到10% BSA溶液。
- 10 mM PA储备液
称取27.841 mg的棕榈酸钠(Sodium palmitate),加入1 mL PBS中,70 °C加热溶解得到100 mM 的原液,之后与9 mL 10% BSA溶液混合,55 °C加热至溶液澄清,即可得到10 mM PA储备液。-20 °C分装保存,使用时用培养基稀释至所需浓度。
- DMEM/HIGH GLUCOSE完全培养基
DMEM/HIGH GLUCOSE培养基450 mL+FBS 50 mL+Penicillin/Streptomycin 5 mL。
致谢
基金项目(Foundation): 国家科技部“重大新药创制”科技重大专项(No 2018ZX09101001-003-007)。
参考文献
- Koh, C. H. and Cheung, N. S. (2006). Cellular mechanism of U18666A-mediated apoptosis in cultured murine cortical neurons: bridging Niemann-Pick disease type C and Alzheimer's disease. Cell Signal 18(11): 1844-1853. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16797161
- Luo, J., Yang, H. and Song, B. L. (2020). Mechanisms and regulation of cholesterol homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol 21(4): 225-245.
- Maxfield, F. R. and Wustner, D. (2012). Analysis of cholesterol trafficking with fluorescent probes. Methods Cell Biol 108: 367-393.
- Wilhelm, L. P., Voilquin, L., Kobayashi, T., Tomasetto, C. and Alpy, F. (2019). Intracellular and Plasma Membrane Cholesterol Labeling and Quantification Using Filipin and GFP-D4. Methods Mol Biol 1949: 137-152.
Please login or register for free to view full text
View full text
Download PDF
Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:董云霞, 陈静, 任进. (2021). 细胞内游离胆固醇的标记和定量. // 高内涵成像及分析实验手册.
Bio-101: e1010832. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010832.
How to cite: Dong, Y. X., Chen, J. and Ren, J. (2021). Free Cholesterol Labeling and Quantification. // High-Content Imaging and Analysis Protocol eBook.
Bio-101: e1010832. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010832.