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Experiment of Low-density Lipoprotein Absorption   

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摘要:Human Dil-Low Density Lipoprotein (Human Dil-LDL) 是标记了荧光探针 Dil (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) 的低密度脂蛋白 (LDL),可用于观察和检测细胞内或细胞膜上LDL的分布和数量。肝细胞系对低密度脂蛋白的吸收实验可以间接表征肝脏清除血液中LDL-C (低密度脂蛋白-胆固醇) 的能力。本实验在对HepG2细胞进行不同处理后,通过基于图像的高内涵筛选 (high content screening, HCS) 分析细胞内Human Dil-LDL的数量,来评估不同处理对细胞吸收LDL能力的影响。

关键词: Dil-LDL, LDL, 荧光检测

材料与试剂

  1. 96 Well Black Assay Plate, Clear Bottom with Lid, 3603 (Corning Costar, Cambridge, MA, catalog number: 04119005)
  2. Human Dil-Low Density Lipoprotein (上海翊盛生物科技有限公司,Yeason,catalog number: 20614ES76)
  3. Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA,catalog number: 13778075)
  4. 4% PFA (国药集团化学试剂有限公司)
  5. 20x PBS (上海生工生物工程有限公司,catalog number: B548117)
  6. Hoechst 33342 (上海翌圣生物科技有限公司,Yeason,catalog number: 40731ES10)
  7. MEM/EBSS培养基 (Hyclone, Logan, UT, USA,catalog number: AF29549370)
  8. Penicillin/Streptomycin (Gibco, Germany,catalog number: 15240-062)
  9. Opti-MEM培养基 (Gibco, Germany,catalog number: 31985-070)
  10. HepG2 (ATCC,USA)
  11. Dil-LDL工作液 (见溶液配方)
  12. Hoechst (见溶液配方)
  13. 1x PBS (见溶液配方)

仪器设备

  1. PerkinElmer Operetta CLSTM (PerkinElmer, USA)
  2. 移液器 (Eppendorf)

实验步骤

  1. 利用RNAiMAX试剂,反式转染PCSK9的siRNA (30 nM) 以及阴性对照 (NC),于底部透明的96孔黑板中,按照每个孔20 μl Opti-MEM培养基+ 0.2 μl RNAiMAX + NC/siRNA (终浓度30 nM) 的体系进行溶液配制,之后用每孔100 μl MEM/EBSS培养基以密度为2 x 104个/孔HepG2细胞进行铺板。
    注:实验中的Opti-MEM培养基和MEM/EBSS培养基,使用前需在37 °C烘箱预热15 min左右。
  2. 48 h后,更换无血清培养基 (此时细胞汇合度应为70%-85%),继续培养24 h。
  3. 将之前培养基吸走,每个孔中添加100 μl Dil-LDL溶液 (终浓度为30-40 μg/ml,配置在无血清培养基中)。
  4. 4 h后,用Hoechst染色。吸走含有Dil-LDL的溶液,按照Hoechst:MEM/EBSS培养基= 1:2000配制Hoechst工作液,每孔加入100 μl Hoechst工作液。
  5. 5-10 min后,吸走板中培养基,利用1x PBS清洗两次后,加入4% PFA 100 μl/孔。20 min后吸走4% PFA,加入1x PBS 100μl 维持细胞形态。
  6. 利用PerkinElmer Operetta拍照。
  7. 利用细胞内红色荧光聚集的点的个数除以细胞个数,得到实验结果。

结果与分析

  1. 首先利用Hoechst的蓝紫光确定细胞核的个数。 (Hoechst 激发波长:360 nm;发射波长:460 nm。)
  2. 利用红色荧光找到Dil-LDL的荧光,并计算聚集点的个数。 (Dil-LDL激发波长:488 nm;发射波长:565 nm。)
  3. 红色荧光聚集的点的个数除以细胞个数,得到实验结果。


    图 1. Dil-LDL 荧光探针法检测细胞对LDL的吸收能力


    前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (PCSK9) 可以在细胞内外通过与低密度脂蛋白受体(LDLR) 的相互作用影响LDLR的降解,从而减弱细胞对LDL-C的吸收 (范磊,2020)。本实验利用PCSK9的siRNA,来验证当细胞内PCSK9被敲低后,细胞是否会对LDL-C的吸收增强,进而验证利用Dil-LDL来指征细胞对LDL吸收能力的可行性 (Du et al., 2016)。
    最终实验结果也证明了,当细胞内PCSK9被敲低后,细胞对于LDL-C的吸收能力增强。

注意事项

  1. 严格注意Dil-LDL的保质期,过期后会导致荧光信号极其不稳定。
  2. 固定完细胞的板子不可低温储存。

溶液配方

  1. Dil-LDL工作液:使用前半小时,按照Dil-LDL试剂的初始浓度,利用无血清培养基,将其稀释成30-40 μg/ml。
  2. Hoechst:用无菌超纯水配制成10 mg/ml的储存液,-20 °C避光保存。
  3. 1x PBS:取50 ml 20x PBS加入ddH2O并定容至1 L,高压蒸汽灭菌,冷却后室温保存待用。
  4. MEM/EBSS完全培养基:MEM/EBSS培养基 450 ml,FBS 50 ml,Penicillin/Streptomycin 5 ml。

致谢

感谢实验室范磊博士和侯蕾等人对于此方法的摸索。基金项目 (Foundation):国家科技部"重大新药创制"科技重大专项 (No 2018ZX09101001-003-007)。

参考文献

  1. 范磊. (2020). miR-552-3p改善糖脂代谢失调性疾病作用发现及机制研究. 博士学位论文. 中国科学院大学 (中国科学院上海药物研究所).
  2. Du, Y., Li, S., Cui, C. J., Zhang, Y., Yang, S. H. and Li, J. J. (2016). Leptin decreases the expression of low-density lipoprotein receptor via PCSK9 pathway: linking dyslipidemia with obesity. J Transl Med 14(1): 276.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:许啸鼎, 陈静, 任进. (2021). 低密度脂蛋白吸收试验. Bio-101: e1010831. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010831.
How to cite: Xu, X. D., Chen, J. and Ren, J. (2021). Experiment of Low-density Lipoprotein Absorption. Bio-101: e1010831. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010831.
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