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Investigation of Cellular PAR Using High-Content Imaging System   

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摘要:DNA编码化合物库 (DEL) 是一种含有百万甚至上亿个含有特异性DNA标签的 巨型化合物库,利用靶标蛋白与DNA编码的小分子之间的亲和力进行筛选,最后通过PCR扩增和深度测序技术实现筛选信息的高通量解码 (Brenner and Lerner, 1992; Ma et al., 2019)。我们利用光交联技术和点击化学,成功构建了首个基于天然产物的DNA 编码化合物库 (nDEL)。针对靶标蛋白PARP1 (聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1) 我们筛选 得到了一个小分子抑制剂-木犀草素 (Luteolin)。细胞中的DNA一旦发生单链断裂损 伤,PARP1蛋白DNA结合结构域可以迅速地结合到损伤位点,C端的催化结构域催化NAD+分解为ADP核糖和烟酰胺,然后以ADP核糖为底物,在自身及其他蛋白的谷氨酸、天冬氨酸等残基上进行聚腺苷二磷酸核糖 (Poly [ADP-ribose], PAR) 长链修 饰,招募其他蛋白参与到DNA损伤修复等重要功能中。为了进一步探究木犀草素对于细胞内PARP1的活性抑制能力,我们使用高内涵成像技术的方法检测木犀草素处理后细胞内聚腺苷二磷酸核糖PAR生成的情况 (Yuan et al., 2017; Li et al., 2020)。

关键词: PARP1, PAR, 高内涵成像, PARP1抑制剂, DNA损伤

材料与试剂

  1. 96孔培养板 (Greiner Bio-One, catalog number: 655090)
  2. Fetal Bovine Serum胎牛血清 (Gibco, catalog number: 10100147)
  3. 一抗pADPr (10H) (Santa Cruz, catalog number: sc-56198)
  4. 二抗Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 (Invitrogene, catalog number: A32723)
  5. DAPI (碧云天, catalog number: C1002)
  6. DMEM培养基 (Gibco, catalog number: 11995065)
  7. PBS (上海源培生物科技有限公司, catalog number: B310KJ)
  8. 木犀草素 (美仑生物, catalog number: MB2172)
  9. olaparib (美仑生物, catalog number: MB1700)

仪器设备

  1. 哺乳动物细胞二氧化碳恒温培养箱 (Thermo Fisher Scientific, HERACELL 150i)
  2. ELISA平板洗板机 (Biotek)
  3. 高内涵成像系统 (Perkin Elmer)

实验步骤

我们以来源于胰腺癌的BRCA缺陷型细胞Capan-1为例进行研究。强氧化剂 (过氧化 氢) 处理细胞后,会引起DNA损伤,产生断裂。处理后的细胞依次与抗PAR抗体、 荧光二抗孵育,检测不同浓度小分子抑制剂作用下,Capan-1细胞平均荧光强度的变 化情况。本次实验使用阳性小分子奥拉帕尼 (Olaparib) 与待检测的小分子木犀草素 (Luteolin) 进行检测。具体实验步骤如下:

一、实验操作部分

  1. 第1天
    将处于对数生长期的Capan-1细胞以90 μl, 20,000个/孔接种于96孔培养板, 37 °C,5% CO2静置培养过夜。
  2. 第2天
    2.1
    每孔加入10 μl不同浓度的小分子药物,每个浓度至少设三个重复。放置于培 养箱中继续培养4 h (使用前先将阳性小分子Olaparib与待检测的小分子木犀 草素溶解于DMSO,配置成浓度为10 mM的母液;根据小分子浓度梯度,加 样前用含10% DMSO的PBS溶液配置10倍工作浓度的小分子溶液,依次加 到对应的孔中,每个孔DMSO终浓度为1%)。
    2.2
    每孔加入2 μl过氧化氢 (终浓度为200 μM),设置加与不加过氧化氢的对照; 细胞在培养箱中继续培养5 min。
    2.3
    弃去上清,每孔加入100 μl预冷甲醇,4 °C固定20 min。孵育结束后PBS 洗6遍,每孔300 μl。
    2.4
    加入一抗pADPr (10H) (稀释比例为1:200),用含1 mg/ml BSA及0.05% Tween-20的PBS (B-PBST) 稀释,室温震荡孵育1 h。之后B-PBST清洗 3遍。
    2.5
    加入Alexa Fluro 488耦连的抗鼠IgG二抗,稀释比例为1:200,室温震荡孵 育20 min。
    2.6
    按照稀释比列为1:2,000加入1 mg/ml的核染料DAPI,室温下避光静止15 min。B-PBST洗6遍。
    2.7
    孵育结束后,加入100 μl B-PBST,使用高内涵成像系统 (Operetta High-Content Imaging System) 进行检测。抑制率% = (I _max - I _treated) / (I _max - I _blank) × 100%。
    I为高内涵成像系统给出的平均荧光强度 (Luminescence)。I _blank为未加入过氧化氢处理,加入1% DMSO处理的细胞的平均荧光强度。I _max为加入过氧化氢处理,加入1% DMSO处理的细胞的平均荧光强度。I _treated为实验组平均荧光强度。统计每个孔的平均荧光强度,利用Graphpad软件统计绘制,计算对应的IC50值 (见图2)。

二、高内涵成像系统操作部分

  1. 将上述实验板用擦镜纸分别将孔板底部擦拭干净后放入PE高内涵成像仪Operetta中进行成像。
  2. 使用10x长工作距离物镜,打开Harmony软件,添加A488绿色 (Ex460-490/Em500-550),DAPI蓝色 (Ex360-400/Em410-480) 成像通道,选择空白细 胞孔 (未加过氧化氢处理,未加小分子)、阳性对照孔 (加过氧化氢处理,未加小 分子) 进行预扫后确定成像条件:曝光时间,聚焦高度,激发光强度。确定条件 后每孔选择6视野进行拍摄。
  3. 成像后利用Columbus 软件进行分析计算。计算流程及说明见表1及图1。


    1. Columbus 软件高内涵分析界面

    1. Columbus软件高内涵分析流程及说明


结果与分析

如图2,高内涵检测结果:蓝色为使用DAPI染色的细胞核,绿色为使用荧光抗体孵育 染色后的PAR染色结果。olaparib与木犀草素抑制曲线,纵坐标为根据归一化之后每 个孔样品平均FITC荧光强度计算的抑制率。细胞内PAR的形成与木犀草素与阳性对照奥拉帕尼都具有一定的剂量依赖效果。两种小分子对细胞内PAR形成抑制的IC50分别约为25.4 μM与2.5 nM。


2. 高内涵成像结果与半数抑制浓度IC50计算

致谢

感谢免疫化学研究所高通量平台对于高内涵成像的技术支持。该研究受到了国家自然科学基金 (21977070, 31500632,U19A2011) 资助。本实验已发表于文章Li et al. (2020)。该实验方案也参考了Yuan et al. (2017) 文章。

参考文献

  1. Brenner, S. and Lerner, R. A. (1992). Encoded combinatorial chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A 89(12): 5381-5383.
  2. Li, J., Li, Y., Lu, F., Liu, L., Ji, Q., Song, K., Yin, Q., Lerner, R. A., Yang, G., Xu, H. and Ma, P. (2020). A DNA-encoded library for the identification of natural product binders that modulate poly (ADP-ribose) polymerase 1, a validated anti-cancer target. Biochem Bioph Res Co 533(2): 241-248.
  3. Ma, P., Xu, H., Li, J., Lu, F., Ma, F., Wang, S., Xiong, H., Wang, W., Buratto, D., Zonta, F., Wang, N., Liu, K., Hua, T., Liu, Z. J., Yang, G. and Lerner, R. A. (2019). Functionality‐Independent DNA Encoding of Complex Natural Products. Angew Chem Int Edit 131(27): 9355-9362.
  4. Yuan, B., Ye, N., Song, S. S., Wang, Y. T., Song, Z., Chen, H. D., Chen, C. H., Huan, X. J., Wang, Y. Q., Su, Y., Shen, Y. Y., Sun, Y. M., Yang, X. Y., Chen, Y., Guo, S. Y., Gan, Y., Gao, Z. W., Chen, X. Y., Ding, J., He, J. X., Zhang, A. and Miao, Z. H. (2017). Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibition and anticancer activity of simmiparib, a new inhibitor undergoing clinical trials. Cancer Lett 386: 47-56.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:李杰, 孔娟, 杨光, 许红涛, 马培翔. (2021). 基于高内涵成像技术的细胞内PAR检测方法. Bio-101: e1010829. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010829.
How to cite: Li, J., Kong, J., Yang, G., Xu, H. T. and Ma, P. X. (2021). Investigation of Cellular PAR Using High-Content Imaging System. Bio-101: e1010829. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010829.
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