实验名称:利用RNA-seq分析并识别基因融合和截断现象
产品名称:RNA HyperPrep Kit with RiboErase (HMR)建库试剂盒   


[KAPA NGS产品在肿瘤研究中的应用] 下一代测序技术 (NGS),又称为大规模平行测序技术,与一代测序技术相比,其在测序速度以及成本上的优势使得该技术在肿瘤研究尤其是肿瘤诊断 (肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌) 及个体化用药治疗上的应用变为可能。
        构建高质量文库是运用NGS技术进行科学/临床研究的第一步也是非常关键的一步。进行肿瘤研究的文库类型主要有以下5种:全基因组测序 (WGS) (针对DNA)、全外显子组测序 (WES) (针对DNA)、全转录组测序 (针对RNA的RNA-seq)、 表观组测序 (甲基化及ChIP-seq)和靶向靶标测序 (DNA和RNA)。
        在科研及临床研究中,用于肿瘤相关研究的原始样品主要包括:FFPE样品、体液、单细胞、游离核酸等。从样品中分离出的用于文库构建的核酸起始样品量比较低 (通常1 ng 到几百ng 不等),且核酸分子质量不高 (降解、损伤)。这些都对构建达到测序标准的高质量文库提出了挑战。
        Roche KAPA文库制备试剂为通过NGS进行肿瘤研究提供了整套解决方案 (Roche Dialog,罗氏诊断在华推广KAPA NGS新一代测序系列产品完善基因检测解决方案)。KAPA人类基因组DNA定量及QC试剂盒可以在单次检测中同时评估样本量及样本质量,严防谨守助力深度测序;Roche DNA文库构建试剂盒 (KAPA HyperPrep Kit, KAPA HyperPlus Kit) 及RNA文库构建试剂盒 (KAPA RNA HyperPrep Kit) 等试剂盒具有操作极简 (一管到底),建库快速 (单日内可完成),文库质量和得率双高等优点;文库定量试剂盒 KAPA Library Quant Kit质量同监,为测序把好最后一道关;而mRNA-capture Kit、RNA-Seq with RiboErase和纯化磁珠对目标核酸分子的富集可有效降低测序成本。这些试剂盒可有效帮助用户获得稳定可靠的测序结果,为后期的科学实验验证及临床研究提供可信的数据依据。 (测序中国, 案例解析: 定向进化的KAPA酶,从困难样本获得高质量NGS数据的“灵魂”)

研究背景

Spitzoid黑色素瘤是一种特殊的形态学变异的黑色素瘤,最常影响儿童和青少年,恶性范围从低级别到恶性不等。这些肿瘤通常由ALK、RET、NTRK1/3、MET、ROS1和BRAF1,2等基因的融合所驱动,然而在约50%的病例中并没有发现这种基因驱动。对一个青少年的spitzoid肿瘤组织进行临床全基因组和转录组测序识别到MAP3K8的基因融合现象,MAP3K8编码了丝氨酸-苏氨酸激酶,该激酶能激活MEK。患者接受了MEK抑制剂治疗并经历了短暂的临床反应。由于可变剪切的存在,RNA-seq能够检测到外显子的边界区域。利用RNA-seq的这种优势,可以进行融合基因的检测,以及评估基因的结构。本研究利用KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase (HMR)建库试剂盒构建临床测序文库,结合公共数据分析并发现MAP3K8重组是spitzoid黑色素瘤中最为常见的遗传事件,存在于成人黑色素瘤中并且可能适于MEK抑制。

生物材料:库存肿瘤FFPE样本

实验目的

对一个青少年的spitzoid肿瘤及另外49例spitzoid肿瘤组织,利用KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase (HMR)建库试剂盒构建去除核糖体的转录组文库,利用RNA-seq识别和验证spitzoid肿瘤中MAP3K8的融合和截断事件。

关键词:黑色素瘤,MAP3K8,基因融合,二代测序,建库,RNA-seq

实验步骤

  1. RNA提取:G4K样本取新鲜冷冻组织,其他样本从FFPE组织切片中提取RNA,约150-200 ng。
  2. RNA质控:利用Qubit (Life Technologies) 和BioAnalyzer (Agilent) 进行质控分析。
  3. RNA文库构建:使用Kapa RNA HyperPrep with RiboErase (HMR) 试剂盒去除核糖体RNA,反转录cDNA,经接头连接,磁珠纯化,获得的cDNA文库经12个PCR进行富集成库,具体操作详见Kapa RNA HyperPrep with RiboErase (HMR) 试剂盒使用手册。
  4. 测序:Illumina HiSeq 4000 双端测序。

实验结果

本研究通过一名11岁青少年spitzoid肿瘤组织全基因组和转录组测序(RNA-seq)分析识别到一个新的MAP3K8的基因融合现象。研究发现MAP3K8基因的exon8和GNG2的exon3发生了融合(见原文中Figure 2b)。并且与未发生重排的病例相比,MAP3K8最后一个exon(exon9)的表达水平发生了下调(见原文中Figure 2c)。
        随后通过对49例spitzoid肿瘤的RNA-seq数据分析发现,22%的患者发生了MAP3K8的融合,并且所有MAP3K8的exon9都被其他编码序列替换掉了 (见原文中Figure 3b)。33%病例出现MAP3K8的框内融合或截断现象。这些融合转录本或截断的基因都包含MAP3K8的1-8外显子,但是缺少最后一个外显子。TCGA数据发现,1.5%的成人黑色素瘤中存在类似的MAP3K8重组。研究认为MAP3K8重组是spitzoid黑色素瘤中最为常见的遗传事件,可能是驱动致癌基因 (见原文中Figure 3a),存在于成人黑色素瘤中并且可能适于MEK抑制剂治疗 (见原文中Figure 2d)。

参考文献

  1. Newman, S., Fan, L., Pribnow, A., Silkov, A., Rice, S. V., Lee, S., Shao, Y., Shaner, B., Mulder, H., Nakitandwe, J., Shurtleff, S., Azzato, E. M., Wu, G., Zhou, X., Barnhill, R., Easton, J., Nichols, K. E., Ellison, D. W., Downing, J. R., Pappo, A., Potter, P. M., Zhang, J. and Bahrami, A. (2019). Clinical genome sequencing uncovers potentially targetable truncations and fusions of MAP3K8 in spitzoid and other melanomas. Nat Med 25(4): 597-602.
  2. 罗氏诊断产品 (上海) 有限公司生命科学部. RNA HyperPrep Kit with RiboErase (HMR)建库试剂盒说明书.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
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