适用说明:本产品说明书适用于KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase (HMR)(KK8560, KK8561, KK8542, KK8544, KK8546, KK8001, KK8481, KK8482)。
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产品描述
用于Illumina测序的含有RiboErase (HMR) 的KAPA RNA HyperPrep试剂盒,包含去除核糖体RNA (rRNA) 和通过总量为25 ng-1 μg的经过纯化的RNA进行链式RNA-Seq文库快速构建所需的所有缓冲液和酶,具体步骤如下:
- 通过互补DNA寡核苷酸的杂交去除rRNA,然后采用RNA酶H和DNA酶处理,以分别去除与DNA和原始DNA寡核苷酸双链化的rRNA;
- 采用加热和镁进行片段化;
- 采用随机引发进行第一条链cDNA合成
- 结合第二条链合成和加A尾,将cDNA:RNA杂交体转化为双链cDNA (dscDNA),将dUTP掺入第二条cDNA链,进行链式RNA测序,并在所得dscDNA的3'末端加入dAMP;
- 接头连接,即在文库插入片段上连接带有3' dTMP端的dsDNA接头;以及
- 文库扩增,使用高保真低偏差PCR,扩增在两端携带适当接头序列的文库片段。标记有dUTP的链未被扩增,允许进行链特异性测序。
该试剂盒提供了用于反应纯化的KAPA纯化磁珠,以及用于rRNA去除、cDNA合成、文库构建和扩增所需的所有酶和缓冲液,但不包括RNA或接头。KAPA接头另售。
反应缓冲液以方便的形式提供,包含所有需要的反应组分。这最大限度地降低了RNA酶污染的风险,确保了反应组分的一致性和均质性,并改善了重复样本之间的均一性。类似地,文库构建过程的每一个步骤都配有单独的酶混合物,从而减少了移液步骤的次数。
为了使序列覆盖均一性最大化,并维持相对的转录本丰度,尽量减少文库扩增偏差是至关重要的。KAPA HiFi DNA聚合酶是为低偏差高保真PCR而设计,是NGS文库扩增的首选聚合酶1, 2, 3, 4。含有RiboErase (HMR) 的KAPA RNA HyperPrep试剂盒包含用于文库扩增的KAPA HiFi热启动高保真酶预混液 (2X) 和文库扩增引物混合物 (10X)。
- Oyola, S.O., et al., BMC Genomics 13, 1 (2012).
- Quail, M.A., et al., Nature Methods 9, 10 -11 (2012).
- Quail, M.A., et al., BMC Genomics 13, 341 (2012).
- Ross, M.G., et al., Genome Biology 14, R51 (2013).
产品应用
含有RiboErase (HMR) 的KAPA RNA HyperPrep试剂盒是设计用于手动操作和自动化地通过总量为25 ng-1 μg的RNA进行NGS文库构建。该试剂盒可用于去除细胞质(5 S、5.8 S、18 S和28 S) rRNA和线粒体 (12 S和16 S) rRNA。该实验方法适用于多种类型的RNA测序应用,包括:
•高质量和低质量RNA样本 (例如,从FFPE组织提取的样本) 的基因表达分析;
•单核苷酸多态性 (SNV) 发现;
•剪切点和基因融合突变识别;以及
•多腺苷酸化和非多腺苷酸化的特征RNAs,包括非编码和未成熟RNAs。
该试剂盒与长度 < 100 bp的小RNA不兼容。
工作流程图
实验操作流程
- 试剂准备
完成该实验方法耗时约6.5小时。理想情况下,应根据需要准备流程中不同步骤的反应预混液。
为获得最高的稳定性和最长的保质期,含有RiboErase (HMR) 的KAPA RNA HyperPrep试剂盒中的酶和反应缓冲液应单独提供。对于精简的实验方法,每一步酶促步骤都需要制备一份至少有10%多余量的试剂反应预混液,如表1-表7中所示。表8列出了含有RiboErase (HMR) 的KAPA RNA HyperPrep试剂盒实验方法中所需的其他试剂的量。
需始终确保KAPA纯化磁珠和PEG/NaCl溶液在使用前已彻底平衡至室温。
表1. 寡核苷酸杂交
表2. rRNA去除
表3. DNA酶消化
表4. 第一条链合成
表5. 第二条链合成与加A尾
表6. 接头连接
表7. 文库扩增
表8. 所需其他试剂的量
- 寡核苷酸杂交和rRNA去除
该实验方法是在10 μL不含RNA酶的水中,需要总量为25 ng-1 μg的RNA。
确保在使用前已准备好了杂交反应预混液 (表1)和去除反应预混液 (表2),并在室温下储存。
- rRNA去除纯化
- DNA酶消化
为了从已去除核糖体的RNA中去除杂交寡核苷酸,将样本与DNA酶一起孵育。确保已制备了DNA酶消化反应预混液 (表3),并保存在室温。
- DNA酶消化纯化
- RNA洗脱、片段化和引发
在片段化、引发和洗脱缓冲液 (1X中,将去除rRNA的RNA从磁珠上洗脱,并在高温下通过孵育将其片段化成所需片段大小。
- 第一条链合成
- 第二条合成与加A尾
- 接头连接
- 第一次连接后纯化
- 第二次连接后纯化
- 文库扩增
- 文库扩增纯化
使用过本产品的部分文献
- Dreyer, S. B., Jamieson, N. B., Evers, L., Duthie, F., Cooke, S., Marshall, J., Beraldi, D., Knight, S., Upstill-Goddard, R., Dickson, E. J., Carter, C. R., McKay, C. J., Biankin, A. V. and Chang, D. K. (2019). Feasibility and clinical utility of endoscopic ultrasound guided biopsy of pancreatic cancer for next-generation molecular profiling. Chin Clin Oncol 8(2):
- Hyle, J., Zhang, Y., Wright, S., Xu, B., Shao, Y., Easton, J., Tian, L., Feng, R., Xu, P. and Li, C. (2019). Acute depletion of CTCF directly affects MYC regulation through loss of enhancer-promoter looping. Nucleic Acids Res 47(13): 6699-6713.
- Lawrence, M. C., Darden, C. M., Vasu, S., Kumano, K., Gu, J., Wang, X., Chan, J., Xu, Z., Lemoine, B. F., Nguyen, P., Smitherman, C., Naziruddin, B. and Giuliano, T. (2019). Profiling gene programs in the blood during liver regeneration in living liver donors. Liver Transpl.
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- Marggraf, M. B., Panteleev, P. V., Emelianova, A. A., Sorokin, M. I., Bolosov, I. A., Buzdin, A. A., Kuzmin, D. V. and Ovchinnikova, T. V. (2018). Cytotoxic potential of the novel horseshoe crab peptide polyphemusin III. Mar Drugs 16(12).
- O'Connell, C. M., Brochu, H., Girardi, J., Harrell, E., Jones, A., Darville, T., Sena, A. C. and Peng, X. (2019). Simultaneous profiling of sexually transmitted bacterial pathogens, microbiome, and concordant host response in cervical samples using whole transcriptome sequencing analysis. Microb Cell 6(3): 177-183.
- Suntsova, M., Gaifullin, N., Allina, D., Reshetun, A., Li, X., Mendeleeva, L., Surin, V., Sergeeva, A., Spirin, P., Prassolov, V., Morgan, A., Garazha, A., Sorokin, M. and Buzdin, A. (2019). Atlas of RNA sequencing profiles for normal human tissues. Sci Data 6(1): 36.
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