产品说明书：KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase (HMR) Illumina^® 平台   

实验操作流程

1. 试剂准备
   完成该实验方法耗时约6.5小时。理想情况下，应根据需要准备流程中不同步骤的反应预混液。
   
   为获得最高的稳定性和最长的保质期，含有RiboErase (HMR) 的KAPA RNA HyperPrep试剂盒中的酶和反应缓冲液应单独提供。对于精简的实验方法，每一步酶促步骤都需要制备一份至少有10%多余量的试剂反应预混液，如表1-表7中所示。表8列出了含有RiboErase (HMR) 的KAPA RNA HyperPrep试剂盒实验方法中所需的其他试剂的量。
   
   需始终确保KAPA纯化磁珠和PEG/NaCl溶液在使用前已彻底平衡至室温。
   
   表1. 寡核苷酸杂交
   
   
   表2. rRNA去除
   
   
   表3. DNA酶消化
   
   
   表4. 第一条链合成
   
   
   表5. 第二条链合成与加A尾
   
   
   表6. 接头连接
   
   
   表7. 文库扩增
   
   
   表8. 所需其他试剂的量
   
   
   
   
   
2. 寡核苷酸杂交和rRNA去除
   该实验方法是在10 μL不含RNA酶的水中，需要总量为25 ng-1 μg的RNA。
   确保在使用前已准备好了杂交反应预混液 (表1)和去除反应预混液 (表2)，并在室温下储存。
   
   
   2.1

   按如下方式设置热循环仪的程序：
   
   
   
   2.2

   按下述方式配制rRNA杂交反应：
   
   
   
   2.3

   将样本置于预编程的热循环仪中，并执行程序。
   2.4

   确保添加了含有RNA酶H的去除反应预混液，同时样本在热循环仪中于45 °C下保存。当程序在45 °C下到达暂停步骤时，在每个20 μL杂交反应中添加以下物质并通过多次上下吹打彻底混合。
   
   
   
   2.5

   恢复循环程序，继续进行去除步骤 (45 °C，持续30分钟)。
   2.6

   立即进行rRNA去除纯化 (步骤3)。
   
   
3. rRNA去除纯化
   3.1

   结合以下方法，进行一次2.2X基于磁珠的纯化：
   
   
   
   3.2

   通过多次上下吹打彻底重悬磁珠。
   3.3

   将板/管在室温下孵育5分钟，以将RNA结合到磁珠上。
   3.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   3.5

   小心吸出并丢弃75 μL的上清液。
   3.6

   将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
   3.7

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   3.8

   小心吸出并丢弃上清液。
   3.9

   将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
   3.10

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   3.11

   小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
   3.12

   在室温下将磁珠干燥3 - 5分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
   
   
4. DNA酶消化
   为了从已去除核糖体的RNA中去除杂交寡核苷酸，将样本与DNA酶一起孵育。确保已制备了DNA酶消化反应预混液 (表3)，并保存在室温。
   
   
   4.1

   按下述方式配制DNA酶消化反应：
   
   
   
   4.2

   通过多次上下吹打彻底重悬磁珠。
   4.3

   将板/管在室温下孵育3分钟以从磁珠上洗脱RNA。
   4.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   4.5

   仔细将20 μL的上清液转移到一个新的板/管中。丢弃带有磁珠的板/管。
   4.6

   采用如下实验方法孵育带有上清液的板/管：
   
   
   
   4.7

   立即进行DNA酶消化纯化(步骤5)。
   
   
5. DNA酶消化纯化
   5.1

   结合以下方法，进行一次2.2X基于磁珠的纯化：
   
   
   
   5.2

   通过多次上下吹打彻底重悬磁珠。
   5.3

   将板/管在室温下孵育5分钟，以将RNA结合到磁珠上。
   5.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   5.5

   小心吸出并丢弃60 μL的上清液。
   5.6

   将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
   5.7

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   5.8

   小心吸出并丢弃上清液。
   5.9

   将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
   5.10

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   5.11

   小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
   5.12

   在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
   
   
6. RNA洗脱、片段化和引发
   在片段化、引发和洗脱缓冲液 (1X中，将去除rRNA的RNA从磁珠上洗脱，并在高温下通过孵育将其片段化成所需片段大小。
   
   
   6.1

   结合如下方法在室温下制备所需量的片段化、引发和洗脱缓冲液(1X)：
   
   
   
   6.2

   通过多次上下移液，在22 μL的片段化、引发和洗脱缓冲液(1X)中，彻底重悬磁珠，这些带有经过纯化和DNA酶处理的RNA。
   6.3

   将板/管在室温下孵育3分钟以从磁珠上洗脱RNA。
   6.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   6.5

   仔细将20 μL的上清液转移到一个新的板/管中。丢弃带有磁珠的板/管。
   安全停止点
   样本可以在-15 °C至-25 °C下储存 ≤ 24小时。准备好后，继续执行步骤6.6。
   6.6

   将板/管置于热循环仪中，并按照如下方法进行片段化和引发程序：
   
   
   
   6.7

   将板/管置于冰上，立即继续进行第一条链合成(步骤7)。
   
   
7. 第一条链合成
   7.1

   在冰上，按照如下所述配制第一条链合成反应：
   
   
   
   7.2

   将板/管置于冰上，通过多次轻轻上下吹打进行彻底混合。
   7.3

   采用如下实验方法孵育板/管：
   
   
   
   7.4

   将板/管置于冰上，立即继续进行第二条链合成与加A尾 (步骤8)。
   
   
8. 第二条合成与加A尾
   8.1

   在冰上，按照如下所述配制第二条链合成与加A尾反应：
   
   
   8.2

   将板/管置于冰上，通过多次轻轻上下吹打进行彻底混合。
   8.3

   采用如下实验方法孵育板/管：
   
   
   8.4

   将板/管置于冰上，立即继续进行接头连接 (步骤9)。
   
   
9. 接头连接
   9.1

   洗脱接头准备连接，目的是获得以下浓度：
   
   
   
   9.2

   在冰上，按照下述方式设置接头连接反应：
   
   
   
   9.3

   将板/管保存在冰上，通过多次上下移液进行彻底混合。
   9.4

   将板/管在20 °C下孵育15分钟。
   9.5

   立即进行第一次连接后纯化 (步骤10)。
   
   
10. 第一次连接后纯化
    10.1

    结合以下方法，进行一次0.63X基于磁珠的纯化：
    
    
    
    10.2

    通过涡旋和/或多次上下吹打进行彻底混合。
    10.3

    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    10.4

    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    10.5

    小心吸出并丢弃175 μL的上清液。
    10.6

    将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
    10.7

    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    10.8

    小心吸出并丢弃上清液。
    10.9

    将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
    10.10

    在室温下将板/管于磁力架上孵育≥30秒。
    10.11

    小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
    10.12

    在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
    注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    10.13

    从磁力架上取下板/管。
    10.14

    在50 μL 10 mM的Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 中彻底重悬磁珠。
    10.15

    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    安全停止点
    含有重悬磁珠的溶液可在2 °C至8 °C储存 ≤ 24小时。不要冰冻磁珠，因为这会导致DNA大量丢失。准备好后，进行第二次连接后纯化 (步骤11)。
    
    
11. 第二次连接后纯化
    11.1

    结合以下方法，进行一次0.7X基于磁珠的纯化：
    
    
    
    11.2

    通过涡旋和/或多次上下吹打进行彻底混合。
    11.3

    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    11.4

    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    11.5

    小心吸出并丢弃80 μL的上清液。
    11.6

    将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
    11.7

    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    11.8

    小心吸出并丢弃上清液。
    11.9

    将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
    11.10

    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    11.11

    小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
    11.12

    在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
    注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    11.13

    从磁力架上取下板/管。
    11.14

    在22 μL 10 mM的Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 中彻底重悬磁珠。
    11.15

    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    11.16

    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    11.17

    将20 μL澄清的上清液移液到新的平板/管中，并进行文库扩增(步骤12)。
    安全停止点
    纯化的接头连接文库DNA可以在2 °C至8 °C下储存 ≤ 1周，或冰冻在-15 °C至-25 °C下储存 ≤ 1个月。准备好后，继续进行文库扩增(步骤12)。
    
    
12. 文库扩增
    12.1

    按如下方式配制每个文库扩增反应：
    
    
    
    12.2

    通过多次上下吹打进行充分混合。
    12.3

    使用以下热循环序列扩增文库：
    
    *非标准(即除外Illumina TruSeq^®)接头/引物组合可能需要对退火温度进行优化。
    
    
    12.4

    进行文库扩增纯化(步骤13)。
    
    
13. 文库扩增纯化
    13.1

    结合以下方法，进行一次1X基于磁珠的纯化：
    
    
    
    13.2

    通过涡旋和/或多次上下吹打进行彻底混合。
    13.3

    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    13.4

    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    13.5

    小心吸出并丢弃95 μL的上清液。
    13.6

    将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
    13.7

    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    13.8

    小心吸出并丢弃上清液。
    13.9

    将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
    13.10

    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    13.11

    小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
    13.12

    在室温下将磁珠干燥3 - 5分钟，或直至所有乙醇挥发。
    注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    13.13

    在22 μL 10 mM的Tris-HCl (pH 8.0-8.5)中彻底重悬已干燥的磁珠。
    13.14

    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    13.15

    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    13.16

    将20 μL澄清的上清液转移到一个新的板/管中，并将纯化的扩增文库在2 °C至8 °C下储存 ≤ 1周，或在 -15 °C至 -25 °C下储存。
    
    

使用过本产品的部分文献：

1. Dreyer, S. B., Jamieson, N. B., Evers, L., Duthie, F., Cooke, S., Marshall, J., Beraldi, D., Knight, S., Upstill-Goddard, R., Dickson, E. J., Carter, C. R., McKay, C. J., Biankin, A. V. and Chang, D. K. (2019). Feasibility and clinical utility of endoscopic ultrasound guided biopsy of pancreatic cancer for next-generation molecular profiling. Chin Clin Oncol 8(2):
2. Hyle, J., Zhang, Y., Wright, S., Xu, B., Shao, Y., Easton, J., Tian, L., Feng, R., Xu, P. and Li, C. (2019). Acute depletion of CTCF directly affects MYC regulation through loss of enhancer-promoter looping. Nucleic Acids Res 47(13): 6699-6713.
3. Lawrence, M. C., Darden, C. M., Vasu, S., Kumano, K., Gu, J., Wang, X., Chan, J., Xu, Z., Lemoine, B. F., Nguyen, P., Smitherman, C., Naziruddin, B. and Giuliano, T. (2019). Profiling gene programs in the blood during liver regeneration in living liver donors. Liver Transpl.
4. Li, W., Wei, D., Liang, J., Xie, X., Song, K. and Huang, L. (2019). Comprehensive Evaluation of white matter damage and neuron death and whole-transcriptome analysis of rats with chronic cerebral hypoperfusion. Front Cell Neurosci 13: 310.
5. Marggraf, M. B., Panteleev, P. V., Emelianova, A. A., Sorokin, M. I., Bolosov, I. A., Buzdin, A. A., Kuzmin, D. V. and Ovchinnikova, T. V. (2018). Cytotoxic potential of the novel horseshoe crab peptide polyphemusin III. Mar Drugs 16(12).
6. O'Connell, C. M., Brochu, H., Girardi, J., Harrell, E., Jones, A., Darville, T., Sena, A. C. and Peng, X. (2019). Simultaneous profiling of sexually transmitted bacterial pathogens, microbiome, and concordant host response in cervical samples using whole transcriptome sequencing analysis. Microb Cell 6(3): 177-183.
7. Suntsova, M., Gaifullin, N., Allina, D., Reshetun, A., Li, X., Mendeleeva, L., Surin, V., Sergeeva, A., Spirin, P., Prassolov, V., Morgan, A., Garazha, A., Sorokin, M. and Buzdin, A. (2019). Atlas of RNA sequencing profiles for normal human tissues. Sci Data 6(1): 36.