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小鼠心脏灌流、脑组织解剖与固定   

蔡予琦蔡予琦*吴锦云吴锦云*吴晓阳吴晓阳应玥应玥邰一琳邰一琳何苗何苗  (*contributed equally to this work)
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摘要:在对脑组织进行切片和免疫染色或原位杂交等实验之前,为了排除血液对实验的干扰,通常会用生理盐水对小鼠心脏灌流后再进行解剖和切片。在灌流时,既可以在左心室插针,也可以经由左心室对主动脉进行插针,后者有助于提升灌流速度和成功率。生理盐水灌流结束后,通常继续灌流多聚甲醛固定脑组织,并在剥离取脑后再进行更长时间的后固定,以便后续切片开展实验。

关键词: 小鼠, 心脏灌流, 主动脉, 多聚甲醛, 固定

材料与试剂

  1. 量筒 (蜀牛)
  2. 烧杯 (蜀牛)
  3. 温度计
  4. 生理盐水 (0.9%氯化钠溶液)
  5. 1.5%戊巴比妥钠溶液 (溶于生理盐水中)
  6. NaH2PO4•2H2O (沪试,catalog number: 20040718)
  7. Na2HPO4•12H2O (沪试,catalog number:10020318)
  8. 多聚甲醛 (Sigma,catalog number: 158127)
  9. NaOH (沪试,catalog number: 10019718)
  10. HCl (生工,catalog number: 10011018)
  11. 去离子水
  12. 4%多聚甲醛溶液 [溶于0.1 M磷酸缓冲液 (PB),pH 7.0~7.4,见溶液配方]

仪器设备

  1. 通风橱
  2. 解剖镊 (瑞沃德,catalog number: F12018-13)
  3. 眼科镊 (瑞沃德,catalog number: F12006-10)
  4. 止血钳 (瑞沃德,catalog number: F21002-12)
  5. 解剖剪 (瑞沃德,catalog number: S13052-12)
  6. 精细剪 (瑞沃德,catalog number: S12005-10)
  7. 血管夹 (瑞沃德,catalog number: R33001-48)
  8. 称量勺 (Fisher Brand,catalog number: 21-101-10)
  9. 1毫升无菌注射器 (洪达,catalog number: zsq08)
  10. 4号或5号静脉输液针 (丰临)
  11. 20毫升注射器 (洪达,catalog number: zsq08)
  12. (可选) 恒流泵 (LONGERPUMP,catalog number: BT100-2J)
  13. 带加热装置的磁力搅拌器 (SCILOGEX,catalog number: MS7-H550-Pro)
  14. 分析天平 (SARTORIUS,catalog number: BSA124S)
  15. 微型台式真空泵 (LONGERPUMP,catalog number: BT100-2J)
  16. 50毫升离心管 (THERMO,catalog number: 339652)
  17. 0.22微米PVDF瓶顶过滤器 (Thermo Fisher,catalog number: 291-4520)



    图1. 手术器械

实验步骤

  1. 术前准备
  2. 1.1
    称量小鼠体重并记录 (精确到克)。根据小鼠体重,按照每10克体重注射0.06毫升的剂量,用1毫升无菌注射器吸取适量1.5%戊巴比妥钠溶液备用。
    1.2
    拎起小鼠尾部,将小鼠置于笼架上。一手拉住小鼠尾部使其抓紧笼架、身体绷直,另一只手按住小鼠颈部后,尽可能多地捏住小鼠颈部皮肤,固定小鼠身体,保证小鼠在注射过程中不会移动。     


    2. 小鼠抓取与腹腔注射

    1.3
    将小鼠翻转至腹部朝上,在偏左或偏右的下腹部进针,腹腔注射1.5%戊巴比妥钠溶液。进针不需太深以避免刺入脏器,有明显穿透感但无阻碍感即可 (图2)。
    1.4
    将小鼠放回笼内,等待约5分钟,挤压小鼠脚趾或尾部,观察其是否失去反应,以确认是否进入深度麻醉状态。

    注:对于出生6天以内的新生小鼠,可采用低温麻醉。将新生小鼠放入纸筒、塑料管或包裹在乳胶手套中 (可剪下乳胶手套的拇指部分用于放置小鼠),用碎冰埋至颈部,保持10~15分钟以达成深度麻醉状态。麻醉状态在常温下仅能保持约10分钟,因此不能将小鼠长时间留在手术台上,应尽快进行手术。

    1.5
    (从此步骤起,在通风橱中进行操作) 确认小鼠进入麻醉状态后,将其腹部向上摆放在聚苯乙烯泡沫塑料板或软木材质的手术台上,四肢用胶带或针头/大头针固定,使其在灌流过程中无法随意移动。
           注:若麻醉过量导致小鼠心脏停跳,应尽快开始灌流,避免凝血导致灌流不畅。
    1.6
    剪去中国国家标准4或5号 (对应于国际通用标准的25 G或27 G) 静脉注射针针头尖端的一部分,使其略微变钝 (图3),以防进针时刺破主动脉壁。


    3. 修剪针头 (A) 未修剪针头 (B) 修剪后针头

    1.7
    将静脉注射针连接到提前吸满生理盐水的20毫升注射器上。
    1.8
    取另一20毫升注射器,吸满4%多聚甲醛溶液备用。
  3. 主动脉灌流
    2.1
    用眼科镊拉起胸腔外侧皮毛,用解剖剪剪去皮肤,暴露白色剑突。
    2.2
    用眼科镊拉起剑突,用解剖剪沿剑突下方横向剪开肌肉层,暴露横膈膜。
    2.3
    用精细剪小心剪开横膈膜,注意不要伤到上方的心脏。
    2.4
    沿胸骨外侧剪开两侧肋骨,翻开胸廓前壁并用止血钳固定 (或者将此部分组织完全剪除),以使得心脏完全暴露,可看到颜色较深的右心室 (静脉血) 以及颜色较浅的左心室 (动脉血) (图4)。


    图4. 开胸后示意图

    2.5
    用眼科镊及解剖镊清理心脏周围脂肪组织,暴露升主动脉。
    2.6
    用眼科镊固定心脏,从左心室紧靠心尖处,以大致平行于心脏左右中线的角度刺入注射针 (图5A)。由于针尖已经修钝,进针时会有一定的阻力感;成功穿透心室壁时,会有明确的穿透感 (图5B)。切忌用力过猛,或角度过偏,否则有可能穿过左右心室的间隔,进入右心室,或是直接扎穿整个心脏。
    2.7
    继续沿着初始方向进针,若方向准确,将不会感到明显阻力,并在针头进入主动脉时透过主动脉壁,观察到针头 (图5C~D)。即刻用血管夹夹在针头处 (图5C箭头位置),将其固定于主动脉内。
    注:
    1. 如果不能成功将针头插入主动脉中,也可将其留置于左心室中 (进针约0.5厘米深度),用止血钳夹持固定 (图5B箭头位置),或者用大头针或针头插在手术台上辅助固定。成功进针后,随着心脏的搏动可见回血。
    2. 小于一周龄的幼鼠由于心脏很小,主动脉进针难度很大,且不便用血管夹或止血钳固定针尖与心脏,可考虑采用10毫升手持注射器进行心室灌流。



    图5. 进针步骤。(A) 于左心室尖端,以大致平行于心脏左右中线的角度刺入注射针。(B) 进针约0.5厘米后,可将针头留置于左心室中进行灌流。注意进针方向,避免刺穿左右心室之间的隔膜 (空心箭头)。(C~D) 继续进针,即可将针头送入主动脉中 (C,白色箭头),透过主动脉壁能够观察到针头所在 (D,白色箭头)。利用血管夹固定后,即可进行灌流。(A~C) 为示意图。(D) 为实际进针情况。(E) 灌流前肝脏呈深红色。(F) 生理盐水灌流后失血的肝脏。若一直保持血色或有不均匀的血块,则说明灌流效果不佳。

    2.8
    用精细剪在右心房上剪开一个小口,将观察到深红色血液流出。
    2.9
    手持针管,匀速推注生理盐水,速度约为每5秒1毫升。当针头留置在心室而非主动脉时,应适当调慢速度。除针筒外,也可使用蠕动泵灌注,以更好地控制速度。若进针位置正确,左右心室间隔无破损,将观察到右心房持续流出血液,肝脏逐渐失血 (图5E~F)。若进针位置不准,致使生理盐水直接进入右心室,可能会观察到肺部膨大,甚至有液体从鼻尖流出。若肝脏不能完全失血,保留不均匀的红色,则说明灌流效果不佳。
    注:若进针角度有误或过深导致扎穿心脏或进入右心室,应及时退针重进,一般不会影响灌流效果。
    2.10
    待观察到流出液体变澄清,肝脏完全失血后,可停止生理盐水灌流。一般成年小鼠生理盐水的灌流量约为15~20毫升。
  4. 4%PFA灌流
    3.1
    将静脉注射针换连到提前吸满4%多聚甲醛的20毫升注射器上,注意不可引入气 泡。
    3.2
    手持针管,匀速推注多聚甲醛,速度约为每5秒1毫升。当4%多聚甲醛流经小鼠身体时,可观察到肌肉收缩、胸腔上拱、尾巴翘起摆动等现象,用手触摸颈部可感到较为僵硬,肝脏颜色略微变黄。一般成年小鼠灌流用量约为15~20毫升。
    3.3
    灌流结束后拔出针头,将小鼠从手术台上取下。整个小鼠身体将呈僵直状。
  5. 剥离鼠脑
    4.1
    用解剖剪断颈,剪下小鼠头部 (图6水平虚线,从颈部向鼻尖方向剪开头部上方的皮毛 (图6带箭头虚线),暴露出颅骨。
    4.2
    用解剖剪切除脑干,用精细剪剪除颅骨周围肌肉,暴露颅骨底部枕骨。
    4.3
    将精细剪单侧刀刃平行于鼠脑底部插入枕骨下方,向外分别剪断两侧颅骨。
    4.4
    用解剖镊小心摘除覆盖小脑的颅骨。
    4.5
    将精细剪的单侧刀刃从颅骨中缝处插入,刀刃一侧朝向颅骨,避免损伤脑组织,沿中缝剪开大脑上方至嗅球上方颅骨。直于鼠脑顶部插入中缝剪开颅骨,用解剖镊小心剥离。


    图6. 剥离鼠脑。(A) 断颈,从颈部朝鼻尖方向 (虚线) 剪开头部上方皮毛,暴露颅骨。(B~C) 沿虚线剪除脑干以下的颅骨,依次移除小脑和大脑部位的颅骨,暴露脑组织。

    4.6
    用称量勺 (或其他平面钝头工具) 从鼠脑底部平行插入到嗅球底部,切断下方神经束,取出鼠脑。
    4.7
    将鼠脑放入4%多聚甲醛溶液,4度后固定过夜。
          注:成功灌流的鼠脑颜色呈浅黄色,组织较硬;若血液灌流不彻底,则可能整体或局部呈现血红色,组织较软。后固定后鼠脑体积缩小,颜色加深 (图7)。


    图7. 不同灌流状态鼠脑外观。(A) 未灌流鼠脑,外观呈红色,可见明显红色血管分布; (B) 灌流失败鼠脑,整体外观呈现粉红色; (C) 灌流成功且未进行后固定鼠脑,整体颜色较白; (D) 后固定后鼠脑体积略微缩小,颜色略微加深。

    4.8
    将后固定结束的鼠脑转入含有0.01%叠氮钠的磷酸缓冲盐溶液 (PBS) 中,4度保存;或转入30%蔗糖溶液,待沉底后负20~80度冰冻保存。

失败经验


      表1.  常见问题分析及解决方案

溶液配方

  1. 4%多聚甲醛的配制 (以4 L为例,配制其他体积可参见表2)
    1. 用去离子水清洗量筒、烧杯等;
    2. 使用一次性称量船,分别用分析天平称取12.481克二水合磷酸二氢钠与114.605克十二水合磷酸氢二钠,溶于2升去离子水中;
    3. 将溶液放置于微波炉中最高火加热,每隔3~5分钟取出测量温度,直至溶液温度到达60度;
    4. 用分析天平称取多聚甲醛干粉160克,倒入烧杯底部,避免粉末飞溅;
      注:需穿戴好口罩等防护用品,避免吸入粉末。
    5.  在通风橱内将预热后的磷酸缓冲液倒入盛有多聚甲醛的烧杯;
    6. 将烧杯置于磁力搅拌器上,加入磁力搅拌子,开启磁力搅拌器;打开加热板,设置恰当的加热档,保持烧杯内溶液温度在50~60度之间。待多聚甲醛充分溶解后,加去离子水定容至4升。
      注:可加入1毫升 5摩尔/升氢氧化钠溶液助溶,待多聚甲醛溶解完全后,加入等摩尔量的盐酸中和。若使用12摩尔/升盐酸,则需加入0.4毫升。
      配置5摩尔/升氢氧化钠溶液:在50毫升离心管中称量约2克氢氧化钠,加入10毫升去离子水,轻柔摇晃溶解。氢氧化钠溶解时大量产热,故切勿盖盖或或剧烈摇晃,以防离心管爆炸或溶液飞溅;
    7. 将0.22微米PVDF瓶顶过滤器与微型台式真空泵相连,过滤多聚甲醛溶液;
    8. 过滤后的溶液分装入50毫升离心管,-20度冻存;
      注:每管体积不超过45毫升,以防冰冻后体积增大,溶液溢出。
    9. 冻存后的多聚甲醛溶液使用前可放置4度或室温融化,并充分颠倒混匀。

          表2. 配制不同体积4%多聚甲醛的药品配比

    10.    注:由于甲醛干粉易飞,溶液挥发也会刺激眼睛和呼吸道粘膜,称量和分装需佩戴口罩、护目镜等护具。

伦理学声明

本实验对小鼠进行的所有研究行为均遵循和符合国家《实验动物管理条例》和有关动物保护与使用的法律和法规,并获得复旦大学实验动物中心动物伦理委员会批准。

参考文献

  1. Gage, G. J., Kipke, D. R. and Shain, W. (2012). Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp(65).
  2. https://www.mcgill.ca/research/files/research/305-_transcardiac_perfusion_-_jan_2018_1.pdf
  3. https://www.mbl.edu/bie/files/2015/01/mouse_transcard_perf11.pdf
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Copyright: © 2020 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:蔡予琦, 吴锦云, 吴晓阳, 应玥, 邰一琳, 何苗. (2020). 小鼠心脏灌流、脑组织解剖与固定. Bio-101: e1010353. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010353.
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