流式细胞术检测细胞凋亡 (Annexin V/PI法)   

How to cite Favorites Q&A Share your feedback Cited by

摘要:磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine,PS) 又称复合神经酸,位于正常细胞膜的胞质一侧,在细胞凋亡早期,PS可从细胞膜胞质侧翻转到细胞膜外表面。基于此现象,利用Ca2 +依赖性Annexin V可与PS特异性结合,且亲和力高,适用于细胞凋亡早中期的检测。PI为一种核酸染色剂,与细胞核结合将细胞核染为红色。PI不可透过正常的细胞膜,可透过凋亡中晚期以及坏死细胞的细胞膜,适用于在排除细胞坏死的前提下细胞凋亡中晚期检测。将Annexin V与PI同时使用,通过分群表征出正常、坏死、凋亡和机械性损伤的细胞。在该实验中,我们对HeLa细胞的对照组和H2O2诱导组进行Annexin V/PI双标记,经流式细胞仪检测出不同特性的细胞群。

关键词: 细胞凋亡, Annexin V/PI, 流式检测, HeLa细胞

材料与试剂

  1. 5 ml流式管 (Falcon,catalog number: 352008)
  2. 15 ml离心管 (Falcon,catalog number: 352097)
  3. HeLa细胞
  4. Annexin V-Alexa Fluor™488 (Invitrogen,catalog number: A13201)
  5. PI碘化丙啶 (Sigma-Aldrich,catalog number: P4170)
  6. NaCl 
  7. Na2HPO4 
  8. KCl 
  9. KH2PO4
  10. H2O2
  11. DEME培养基
  12. HEPES
  13. CaCl2
  14. PI染色工作液 (见溶液配方)
  15. 1× Binding buffer (见溶液配方)
  16. PBS (见溶液配方)
  17. 800 μM H2O2 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 水平离心机 (BeckmanCoulter, model: Allegra X-12R)
  2. 光学显微镜 (Olympus, model: IX73)
  3. 流式细胞仪 (FACSFortessa)

实验步骤

  1. 染色前处理
    1.1
    将收集到的细胞,用预冷1× PBS (4 °C) 重悬一次,300 × g , 离心5分钟,弃上清,收集细胞。
    1.2
    加入300 μl的1× Binding Buffer重悬细胞,调整细胞浓度至1 × 106/ml。
  2. Annexin V/PI染色
    2.1
    取流式管,按顺序编好空白管,单阳管和样本管号。流式管中分别加入经200目细胞过滤膜过滤好的100 μl细胞悬液,单阳管中分别加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488或10μl PI碘化丙啶轻轻混匀。
    2.2
    样本管加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488轻轻混匀;再加入10 μl PI碘化丙啶轻轻混匀。
    2.3
    室温避光孵育10~20分钟,加入400 μl 1× Binding Buffer,随后置于冰浴中,上机检测,所选通道如下:
    Alexa Fluor™488:488 nm激发,采集波段530/30;
    PI:561 nm激发,采集波段610/20。

结果与分析


图1. 前向 (FSC) 和侧向 (SSC) 圈出HeLa细胞



图2. Annexin V/PI双标记HeLa细胞凋亡检测


如图1所示通过前向 (FSC) 和侧向 (SSC),分别圈出的对照组和H2O2诱导组的HeLa细胞范围有所差别。诱导凋亡组的细胞已呈现出分群的趋势。图2为Annexin V/PI双标记的结果,如图2A所示对照组的HeLa细胞处于正常状态,但也有少许凋亡晚期的细胞,原因是培养的HeLa细胞浓度过高,导致培养基里的营养消耗过快,少许细胞因饥饿发生凋亡。图2B中显示,经H2O2诱导HeLa细胞出现了显著的早期凋亡现象,比例由1.06%增至7.43%;凋亡晚期的细胞比例呈明显增长趋势。综上可知,双标记方法可以准确地反映凋亡过程:Annexin V标记的单阳性细胞为凋亡早期细胞;Annexin V 与PI双标记的双阳性细胞为凋亡晚期细胞 (Koç,等,2018);PI标记的单阳性细胞为坏死细胞;两者均未标记上的双阴性细胞为活细胞。由此将凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、坏死细胞与正常细胞区别开。因此,可作为检测细胞凋亡的首选方法 (Schutte等,1998) 。

注意事项

  1. 使用前低速离心,以免液体积存管盖和管壁。
  2. 如果用含EDTA的胰酶消化时,注意必须彻底清除EDTA:在标记前用1× PBS或 1× Binding buffer洗涤,清除EDTA,以免残余的EDTA与Ca2+螯合,影响Annexin V的结合。
  3. Annexin V-Alexa Fluor™488和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。在处理和标记时,尽可能在暗处进行。在孵育阶段,用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后,在暗室内用显微镜观察。
  4. 整个操作过程动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞,尽量在4 °C下操作,以免影响细胞状态。
  5. 在细胞洗涤的最后一步,请尽量将上清弃净,以免PBS残留,有可能会影响实验结果。
  6. 为防止荧光衰变,宜在1小时内进行流式检测。
  7. PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高,建议首先进行Annexin V-Alexa Fluor™488染色,最短可在上机前5分钟再加入PI染色。


溶液配方

  1. PBS
    NaCl 8 g
    Na2HPO4 2.9 g
    KCl 0.2 g
    KH2PO4 0.2 g
    溶于1L ddH2O中,调pH值为7.2~7.4
    过滤灭菌
    4 °C保存
  2. 800 μM H2O2 
    取30% H2O2 2 μl溶于880 μl 1× PBS中,配成20 mM的母液
    再取80 μl母液溶于2 ml DEME培养基
  3. PI染色工作液
    1 mg/mL PI原液+无菌PBS按1:10稀释成100 μg/ml工作液
    4 °C保存待用
  4. 1× Binding buffer
    10 mM HEPES
    140 mM NaCl
    2.4 mM CaCl2
    pH 7.4

参考文献

  1. Koç, E. , Çelik-Uzuner, S., Uzuner, U. and Çakmak, R. (2018). The Detailed Comparison of Cell Death Detected by Annexin V-PI Counterstain Using Fluorescence Microscope, Flow Cytometry and Automated Cell Counter in Mammalian and Microalgae Cells. J Fluoresc 28(6): 1393-1404.
  2. Schutte, B., Nuydens, R., Geerts, H. and Ramaekers, F. (1998). Annexin V binding assay as a tool to measure apoptosis in differentiated neuronal cells. J Neurosci Meth 86(1): 63-69.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:葛灵, 王雪冬, 丁宇波, 边玮. (2019). 流式细胞术检测细胞凋亡 (Annexin V/PI法). Bio-101: e1010331. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010331.
How to cite: Ge, L., Wang, X. D., Ding Y. B. and Bian, W. (2019). Flow Detection of Apoptosis by Annexin V/PI. Bio-101: e1010331. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010331.
Q&A

Please login to post your questions/comments. Your questions will be directed to the authors of the protocol. The authors will be requested to answer your questions at their earliest convenience. Once your questions are answered, you will be informed using the email address that you register with bio-protocol.
You are highly recommended to post your data including images for the troubleshooting.

You are highly recommended to post your data (images or even videos) for the troubleshooting. For uploading videos, you may need a Google account because Bio-protocol uses YouTube to host videos.