T细胞增殖的流式检测 (CFSE稀释法)   

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摘要:Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯) 染色法,是一种检测细胞分裂的方法。CFSE能够轻易穿透细胞膜,被细胞内的酯酶除去醋酸酯组分后产生荧光,而未进入细胞的CFSE无荧光 (Quah等,2007)。荧光态的CFSE与细胞内的氨基共价结合,偶联到蛋白上,伴随细胞分裂过程,平均分配到子代细胞中,子代细胞荧光强度减少一半。荧光强度随子代细胞分裂而递减,通过流式细胞技术,能够检测荧光强度递减产生的不同荧光强度的峰,可以监测细胞分裂状态,检测细胞增殖情况 (Fulcher和Wong,1999)。以体外OTII多肽刺激小鼠脾脏细胞为例,用CFSE标记脾脏细胞,添加刺激T细胞的OTII多肽,体外培养脾脏细胞,刺激其中的T细胞使其增殖,流式细胞技术检测T细胞增殖情况。通过选取不同时间节点检测T细胞分裂状态,验证OTII多肽对T细胞增殖的影响。

关键词: CFSE稀释法, T细胞增殖, 流式细胞技术

材料与试剂

  1. Cell strainer 70 μm (Falcon, catalog number: 352350)
  2. 96孔细胞培养板 (Jet Biofil, catalog number: 011096)
  3. 35 mm细胞培养皿 (Corning, catalog number: 430165)
  4. 离心管 (15 ml, 50 ml) (Jet Biofil, catalog number: CFT011150, CFT011550)
  5. 移液管 (5 ml, 10 ml) (Jet Biofil, catalog number: GSP010005, GSP010010)
  6. 1 ml 注射器 (上海康德莱企业发展集团股份有限公司)
  7. TCR转基因OTII小鼠 (Jackson Lab)
  8. Anti-CD16/32 (clone 2.4G2) (BioLegend, catalog number: 101301)
  9. APC anti-mouse CD3ε (BioLegend, catalog number: 100312)
  10. FBS (Gibco, catalog number: 10270)
  11. OTII (上海强耀生物科技有限公司合成)
  12. IL-2 (北京四环生物制药有限公司,catalog number: 国药准字S10970018)
  13. PBS (Hyclone, catalog number: SH30256.01)
  14. RPMI-1640 (Hyclone, catalog number: SH30809.01)
  15. Penicillin/Streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010)
  16. L-Glutamine (Amresco, catalog number: 0374)
  17. β-ME (Amresco, catalog number: 0482)
  18. CFSE (Invitrogen, catalog number: C1157)
  19. DMSO (Sigma-Aldrich, catalog number: 101871790)
  20. 10× Lysing buffer (BD Bioscience, catalog number: 555899)
  21. NaCl (Sigma-Aldrich, catalog number: V900058-500g)
  22. KCl (Sigma-Aldrich, catalog number: V900068-500g)
  23. Na2HPO4 (Sigma-Aldrich, catalog number: V900060-500g)
  24. KH2PO4 (Sigma-Aldrich, catalog number: V900041-500g)
  25. NaN3 (Amresco, catalog number: 0639-250g)
  26. RPMI完全培养基 (见溶液配方)
  27. OTII多肽溶液 (见溶液配方)
  28. CFSE溶液 (见溶液配方)
  29. 1× lysing buffer (见溶液配方)
  30. 10× PBS (1 L, pH = 7.3) (见溶液配方)
  31. FACS buffer (见溶液配方)
  32. Stain mixture (见溶液配方)

仪器设备

  1. 离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge 5810)
  2. Vortex振荡器 (Kylin-bell)
  3. 流式细胞仪 (Beckman Coulter, model: Cytoflex S)
  4. 移液器 (Eppendorf)
  5. 高压灭菌锅 (Boxun, model: YXQ-LS-100S11)

实验步骤

  1. 断颈处死小鼠,用70%酒精消毒处理,取出小鼠脾脏,置于70 μm cell strainer上;
  2. 将装有脾脏的cell strainer置于35 mm的细胞培养皿中,然后加入4 ml的完全培养基,使用平底的1 ml注射器进行脾脏研磨;
  3. 研磨释放脾脏细胞,将脾脏细胞悬液放入50 ml 离心管,再次加入4 ml RPMI完全培养基,冲洗cell strainer,细胞悬液同样放入50 ml 离心管;
  4. 450 x g离心5 min,弃去上清;
  5. 红细胞裂解,加入2 ml 1× lysing buffer,室温放置2 min.
    注:若脾脏较小,可选择用1 ml 1× lysing buffer,或裂解红细胞1 min。
  6. 加入20 ml 1× PBS,中和裂解液,450 x g离心5 min,弃去上清;
  7. 细胞计数,用于后续实验,参见视频1;

    视频1. 脾脏研磨获取单细胞悬液

  8. 按照所需要的细胞总量进行细胞重悬:
    若细胞总数小于5 × 107,离心,1 ml 2% FBS/PBS重悬,放置于15 ml离心管中,
    若细胞总数大于5 × 107,离心,PBS重悬至5 × 107/ml,放置于15 ml离心管中;
  9. 用1× PBS稀释CFSE至10 μM (2×);
  10. 将等体积的10 μM CFSE加入至待标记的脾脏细胞悬液中,终浓度为5 μM,立即vortex混匀,包上铝箔纸,室温放置7 min;
    注:若细胞量较少,可以降低CFSE浓度,如终浓度降至2 μM,或者减少标记时间至5 min;
  11. 加入10 ml RPMI完全培养基,vortex混匀,室温放置2 min, 450 x g离心5 min,弃去上清;
  12. 重复步骤11;
  13. 用含IL-2的RPMI完全培养基重悬脾脏细胞至5 × 106/ml,每孔100 μl种于96孔板,即每孔细胞数为5 × 105,参见视频2;

    视频2. 脾脏细胞CFSE染色

  14. OTII多肽刺激,用含IL-2的RPMI完全培养基稀释OTII至20 μg/ml (2×),每孔100 μl加入96孔板中,终浓度为10 μg/ml,每孔总体积为200 μl,放入细胞培养箱培养;
    注:设置对照实验,需要同时做:脾脏细胞被CFSE标记且刺激的,即实验组;CFSE标记但不刺激的,用来比较有无刺激T细胞的增殖状况;未标记且刺激的和未标记但不刺激的,用来确定脾脏细胞的荧光本底值,确定阳性范围。
  15. 分别在第24 h、48 h、72 h、96 h取细胞用于流式检测,加入150 μl/sample FAC-S buffer,500 x g,离心 3 min,去上清;
  16. 加入50 μl anti-CD16/32 (clone 2.4G2) (200 ng/ml)/sample进行Fc受体封闭, 4 °C放置20 min,封闭结束后,加入150 μl/sample FACS buffer,500 x g,离心 3 min,去上清;
  17. 准备流式抗体APC anti-mouse CD3ε,按照0.15 μl APC anti-mouse CD3ε (0.2 m-g/ml) + 50 μl FACS buffer/sample稀释抗体;
  18. 将稀释好的流式抗体加入样品中,50 μl/sample,vortex混匀,4 °C避光放置25 min;
  19. 加入150 μl/sample FACS buffer,500 x g,离心 3 min,去除上清后,60 μl/sample FACS buffer重悬,进行流式检测,参见视频3。

    视频3. 流式样品处理

结果与分析

多肽OTII刺激后进行流式分析,先通过FSC-A, SSC-A确定脾脏细胞群 (样品脾脏细胞都表达CD45,可不染CD45,其他样品可进行CD45染色,确定淋巴细胞群),再画出T细胞群 (即mouse CD3+ 细胞),选择这群CD3+细胞进行CFSE荧光强度分析 (图1)。


图1. 流式检测T细胞CFSE荧光强度

      未被CFSE标记的脾脏细胞样品,选择CD3+细胞群分析CFSE荧光强度,如图2:


图2.未标记T细胞CFSE荧光强度

        CFSE标记后的脾脏细胞,选择CD3+细胞群分析,左侧图为加入OTII多肽刺激后的流式图,右侧图为无刺激的流式图,从上至下分别为刺激 (左侧) 或培养 (右侧) 24 h、48 h、72 h、96 h的细胞增殖情况,如图3所示:


图3. 流式检测OTII多肽刺激 (左) 与无刺激 (右) T细胞CFSE荧光强度

        OTII刺激脾脏细胞24 h时,未见不同荧光强度的峰,只有单一CFSE高强度峰,此时T细胞还未大量增殖;从第48 h起,开始检测到T细胞分裂,出现三个连续荧光强度的峰;第72 h,在之前的基础上出现一个新的荧光强度低一级的峰 (图3红色箭头所示);第96 h,又一次出现荧光强度低一级的峰 (图3橙色箭头所示),原始CFSE高强度的峰逐渐消失 (图3绿色箭头所示),证明T细胞持续分裂与CFSE标记细胞增殖实验的可行性。
        对比未加入OTII刺激的脾脏细胞,并没有连续CFSE递减的峰出现,说明在无抗原肽刺激的情况下,T细胞增殖不明显。

失败经验

  1. 进行CFSE标记时,加入CFSE染料一定要均匀,确保每个细胞标记CFSE的强度一致;
  2. 尽量使用原代细胞完成实验,培养时间久的细胞再次刺激分裂能力较弱,CFSE标记后出现递减荧光强度峰的数量会减少;
  3. 当细胞数量少时,用2% FBS/PBS重悬细胞,并降低CFSE工作浓度,缩短标记时间,可以减少CFSE对细胞的损伤,保持细胞分裂能力;
  4. 若对刚标记完的细胞进行流式检测,会发现CFSE的荧光强度很高但不稳定,18 h后会恢复到稳定的荧光强度;
  5. 选择与CFSE (FITC) 无补偿的荧光颜色标记CD3,方便流式检测;
  6. 随着T细胞的活化,mouse CD3信号会减弱,选择T细胞群时,需要根据实际读出的CD3的位置画门,确定T细胞群。

溶液配方

  1. RPMI完全培养基
    RPMI-1640
    500 ml
    FBS
    60 ml
    Penicillin/Streptomycin
    5.5 ml
    L-glutamine (200 mM)
    5.5 ml
    β-ME (1 mol/l)
    27.5 μl
    IL-2 (105 IU/ml)
    280 μl
  2. OTII多肽溶液
    用DMSO溶解OTII多肽,至20 mg/ml
  3. CFSE溶液
    用DMSO溶解CFSE,至10 mM
  4. 1× lysing buffer
    10× lysing buffer用经过高压蒸汽灭菌后的ddH2O 10倍稀释,即得1× lysing buffer
  5. 10× PBS (1 L, pH=7.3)
    NaCl
    80 g
    KCl
    10 g
    Na2HPO4
    14.4 g
    KH2PO4
    2.4 g
    将上述试剂加入800 ml ddH2O依次溶解,待所有试剂完全溶解后,加入ddH2O定容至1 L,高压蒸汽灭菌,冷却后室温保存待用
  6. FACS buffer
    10× PBS
    100 ml
    10× PBS
    10 ml
    NaN3 (20%)
    2.5 ml
    使用量筒量取100 ml 10× PBS,加入800 ml ddH2O进行稀释,再加入10 ml FBS和2.5 ml NaN3 (20%),混合均匀后,加入ddH2O定容至1 L,放入4 °C备用
  7. Stain mixture
    APC anti-mouse CD3ε (0.2 mg/ml)
    0.15 μl
    FACS buffer
    50 μl
    按照每个样品50 μl准备stain mixture,50 μl FACS buffer加入0.15 μl流式抗体APC anti-mouse CD3ε (0.2 mg/ml),混匀备用

致谢

感谢杨选明实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (81671643)、科技部重点研发计划 (2016YFC1303400) 资助。

参考文献

  1. Fulcher, D. and Wong, S. (1999). Carboxyfluorescein succinimidyl ester-based proliferative assays for assessment of T cell function in the diagnostic laboratory. Immunol Cell Biol 77(6): 559-564.
  2. Quah, B. J., Warren, H. S. and Parish, C. R. (2007). Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc 2(9): 2049-2056.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:戚馨月, 杨选明. (2019). T细胞增殖的流式检测 (CFSE稀释法). Bio-101: e1010313. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010313.
How to cite: Qi, X. Y. and Yang, X. M. (2019). Analyzing T Cell Proliferation through CFSE Dilution Assay. Bio-101: e1010313. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010313.
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