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T细胞增殖的流式检测 (CFSE稀释法)

Analyzing T Cell Proliferation through CFSE Dilution Assay

戚 戚馨月
杨 杨选明

发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010313 浏览次数: 31889

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流式细胞术实验手册
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摘要：Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯) 染色法，是一种检测细胞分裂的方法。CFSE能够轻易穿透细胞膜，被细胞内的酯酶除去醋酸酯组分后产生荧光，而未进入细胞的CFSE无荧光 (Quah等，2007)。荧光态的CFSE与细胞内的氨基共价结合，偶联到蛋白上，伴随细胞分裂过程，平均分配到子代细胞中，子代细胞荧光强度减少一半。荧光强度随子代细胞分裂而递减，通过流式细胞技术，能够检测荧光强度递减产生的不同荧光强度的峰，可以监测细胞分裂状态，检测细胞增殖情况 (Fulcher和Wong，1999)。以体外OTII多肽刺激小鼠脾脏细胞为例，用CFSE标记脾脏细胞，添加刺激T细胞的OTII多肽，体外培养脾脏细胞，刺激其中的T细胞使其增殖，流式细胞技术检测T细胞增殖情况。通过选取不同时间节点检测T细胞分裂状态，验证OTII多肽对T细胞增殖的影响。

Keywords: CFSE稀释法 search T细胞增殖 search 流式细胞技术 search

材料与试剂

  1. Cell strainer 70 μm (Falcon, catalog number: 352350)
  2. 96孔细胞培养板 (Jet Biofil, catalog number: 011096)
  3. 35 mm细胞培养皿 (Corning, catalog number: 430165)
  4. 离心管 (15 ml, 50 ml) (Jet Biofil, catalog number: CFT011150, CFT011550)
  5. 移液管 (5 ml, 10 ml) (Jet Biofil, catalog number: GSP010005, GSP010010)
  6. 1 ml 注射器 (上海康德莱企业发展集团股份有限公司)
  7. TCR转基因OTII小鼠 (Jackson Lab)
  8. Anti-CD16/32 (clone 2.4G2) (BioLegend, catalog number: 101301)
  9. APC anti-mouse CD3ε (BioLegend, catalog number: 100312)
  10. FBS (Gibco, catalog number: 10270)
  11. OTII (上海强耀生物科技有限公司合成)
  12. IL-2 (北京四环生物制药有限公司，catalog number: 国药准字S10970018)
  13. PBS (Hyclone, catalog number: SH30256.01)
  14. RPMI-1640 (Hyclone, catalog number: SH30809.01)
  15. Penicillin/Streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010)
  16. L-Glutamine (Amresco, catalog number: 0374)
  17. β-ME (Amresco, catalog number: 0482)
  18. CFSE (Invitrogen, catalog number: C1157)
  19. DMSO (Sigma-Aldrich, catalog number: 101871790)
  20. 10× Lysing buffer (BD Bioscience, catalog number: 555899)
  21. NaCl (Sigma-Aldrich, catalog number: V900058-500g)
  22. KCl (Sigma-Aldrich, catalog number: V900068-500g)
  23. Na2HPO4 (Sigma-Aldrich, catalog number: V900060-500g)
  24. KH2PO4 (Sigma-Aldrich, catalog number: V900041-500g)
  25. NaN3 (Amresco, catalog number: 0639-250g)
  26. RPMI完全培养基 (见溶液配方)
  27. OTII多肽溶液 (见溶液配方)
  28. CFSE溶液 (见溶液配方)
  29. 1× lysing buffer (见溶液配方)
  30. 10× PBS (1 L, pH = 7.3) (见溶液配方)
  31. FACS buffer (见溶液配方)
  32. Stain mixture (见溶液配方)

仪器设备

  1. 离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge 5810)
  2. Vortex振荡器 (Kylin-bell)
  3. 流式细胞仪 (Beckman Coulter, model: Cytoflex S)
  4. 移液器 (Eppendorf)
  5. 高压灭菌锅 (Boxun, model: YXQ-LS-100S11)

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：戚馨月, 杨选明. (2019). T细胞增殖的流式检测 (CFSE稀释法). Bio-101: e1010313. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010313.
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How to cite: Qi, X. Y. and Yang, X. M. (2019). Analyzing T Cell Proliferation through CFSE Dilution Assay. Bio-101: e1010313. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010313.
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分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

免疫学 > 免疫细胞分化 > T 细胞

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