基于单片机控制的果蝇睡眠剥夺方法   

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A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

 

摘要:睡眠是普遍存在的基本生命活动,受节律和稳态系统共同调控。果蝇具有睡眠样行为。通过睡眠剥夺系统,可以评估果蝇睡眠稳态系统的调控能力。本系统由睡眠检测板、人工气候箱、混合器、微型计算机和单片机控制器等构成。在检测果蝇睡眠的同时,利用混合器强大的震荡能力,对检测板中的果蝇施加机械振动,剥夺果蝇睡眠。混合器的时域参数,通过单片机和电磁继电器组合控制,在一定程度上实现了可编程与自动化控制。最后得到的睡眠检测数据,可利用专业软件进行分析。

关键词: 睡眠剥夺, 混合仪, 单片机

材料与试剂

  1. 果蝇饲养瓶 (19.5 cm2 × 10 cm无色玻璃)
  2. 果蝇睡眠检测用管 (12.5 mm2 × 6.5 cm无色玻璃)
  3. 烧杯
  4. 皮筋
  5. 玻璃培养皿 (或者塑料皿)
  6. 毛笔
  7. 带孔塑料塞 (或棉花塞)
  8. 果蝇,如:w1118 (FlyBase ID:FBst0005905)
  9. 红糖 (甘汁园纯正红糖)
  10. 丙酸 (国药,沪试,catalog number:81011918)
  11. 琼脂粉 (BIOSHARP JANPAN)
  12. 睡眠监测期间果蝇食物 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 烘箱
  2. 光照培养箱 (55 cm × 55 cm × 150 cm,宁波海曙赛福科技有限公司)
  3. 体视显微镜 (Nikon SMZ745)
  4. CO2麻醉板 (Flystuff Flypad Frame,catalog number: 59-118)
  5. 果蝇行为监测系统 (DAM2 Trikinetics,Waltham,MA,USA)
  6. 多管漩涡混合器 (UMV-2,北京优晟联合科技有限公司,购于阿里巴巴平台)
  7. 单路继电器模块 (天猫商城,telesky旗舰店)
  8. 单片机控制四路继电器模块 (淘宝商城,海森豪电子网络营销部)
  9. 直流电源 (DC12V 10A,天猫商城,NVVV君临专卖店)

软件

  1. 数据收集软件DAMSystem

实验步骤

一、睡眠剥夺系统搭建

  1. 改装混合器
    市场上购买的混合器,普遍具有较好的震荡效果,但是控制面板相对简单,无法实现时域或者频域控制。为解决这一问题,需要对混合器进行改装。
    1.1
    将混合器拆开,找到启动震荡的微动开关 (形状如图1A,位于图1B的Start/Stop按键下方)。从微动开关的任意两个对侧针脚,用锡焊焊接两根导线,两根导线另一端均引出到混合器之外 (图1B)。
    1.2
    将混合器重新安装完好,通电后检查混合器是否可以正常工作。特别注意,引出的导线可以直接控制混合器的启动,方为成功。在混合器通电的情况下,两根导线对接一次,混合器启动,再对接一次,混合器停止工作。故将引出线命名为Control line1和Control line2 (图1B)。


    图1. 微动开关与Control lines


  1. 安放混合器
    2.1
    混合器震动产生巨大动能,故将其放入独立培养箱中。
    2.2
    混合器下部铺设海绵和垫片达到缓震效果 (图2A和2B)。
    2.3
    混合器的震荡转速设置为1,200~1,500 rpm为宜,可以根据实际情况进行调整。
    2.4
    Control lines用胶带固定,防止导线抖动导致接触不良。Control lines引出到培养箱之外,保证Control lines具有一定的长度 (> 20 cm)。


    图2. 混合器放置图

  1. 单片机编程
    由于作者知识结构限制,在此仅做简要介绍,请有兴趣的读者自行学习单片机的设计和使用原理。
    图3所示的四路继电器单片机以及编码服务,购买于淘宝网店“海森豪电子网络营销部”,商品简要介绍见附录1,网址:
    https://ly889.taobao.com/index.htm?spm=2013.1.w5002-4171188017.2.5613196bxiaUZi
    大致流程如下:
    3.1
    图3A单片机使用KeilC51Vcngr编译器,需购买和安装该软件。
    3.2
    在编译器中编写代码,实现控制功能:当单片机接收到触发信号后,在170 s的时间区间内,随机选择一个时间点,闭合电磁继电器10 s后断开。
    3.3
    使用STC-ISP单片机下载编程烧录软件,将编写代码,通过STC下载器烧录至单片机中。


    图3. 单片机模块和继电器模块实物图

  1. 单片机与继电器联合控制模块搭建
    增加继电器模块,方便震动间隔和震动时间的调节。使用telesky品牌一路继电器模块 (图3B)。telesky继电器模块使用说明见附录2
    4.1
    按照图4连接单片机和继电器模块,注意接口不要连错。



    图4. 导线连接图

    4.2
    参照附录中telesky品牌一路继电器模块使用说明,设置参数,表1供参考。

    表1. 继电器参数设置


    4.3
    按信号控制顺序,设计介绍控制原理如下 (图5):
    1)
    1号继电器模块控制震荡事件的时间区间长度,如表1和图5所示,时间区间长度为CL1 + OP1 = 195 s + 2 s = 197 s,设置循环数LOP1为无限循环。每个循环的第196 s,1号继电器模块闭合模块上的继电器,将高电平信号传输至单片机。
    2)
    单片机收到高电平信号后被触发,在170 s内,随机选择一个时间点闭合电磁继电器10 s。单片机在收到高电平信号3 min之后恢复待机状态,可以接受下一次触发信号。单片机的电磁继电器闭合后,将高电平信号同时传输至2号和3号继电器模块。
    3)
    2号继电器模块控制振荡事件的开始,在接收到来自单片机的高电平信号后被触发,通过闭合2号模块上的继电器,闭合Control line1和Control line2一次,启动震荡事件。2号模块上的继电器闭合OP2 = 10s之后断开,2号继电器模块进入待机状态。
    4)
    3号继电器模块控制震荡事件的持续时间,在接收到来自单片机的高电平信号后被触发,触发后,计时CL3 = 12s,计时结束后,通过闭合3号模块上的继电器,闭合Control line1和Control line2一次,停止震荡事件。闭合时间OP3 = 1s后,继电器断开,3号继电器模块进入待机状态。
    注:CL1和OP1控制时间区间长度,CL3控制震荡时间,按照控制逻辑,可以自行调节各参数,图表所示,是经过验证有效的一种设置方式。需要注意,当CL1 + OP1小于3 min时,会出现逻辑错误。如果实验需要CL1 + OP1小于3 min,则可以通过修改单片机代码实现。若实验需要CL1 + OP1大于3 min,则170 s + CL3之后的部分必然不会有震荡,导致随机性降低,但亦可以通过修改单片机代码,更改单片机选取随机时间的区间长度,根据实际操作经验,可控制必然非震荡时间 < (CL1+OP1) * 10%。需要注意,CL3 < OP2,也会导致逻辑错误。


    图5. 控制原理图

二、果蝇睡眠剥夺

  1. 准备待测果蝇
    使用标准果蝇食物,在饲养瓶中饲养果蝇 (温度:25 °C,湿度:50%,光照:12 h光照/12 h黑暗);监测果蝇年龄应在3~8天。
  2. 准备监测用玻璃管
    2.1
    新的玻璃管壁残留游离碱,玻璃管置于烧杯在双蒸水中加入适量丙酸,煮沸5~10 min;用双蒸水清洗玻璃管两次,在双蒸水中煮沸5 min;用双蒸水清洗玻璃管一次,在双蒸水中煮沸5 min;用双蒸水清洗玻璃管一次。
    2.2
    用皮筋捆扎玻璃管,置于洁净的玻璃培养皿 (或者塑料皿) 中,双蒸水清洗玻璃管4 min,置于烘箱烘干。
    2.3
    使用饮用水,配制终浓度为5%红糖和1.5%琼脂的食物溶液,配制时使用微波加热煮沸5 min以上,间歇搅拌,待冷却至60 °C左右,每100 ml食物加入0.6 ml丙酸。
    2.4
    于洁净的玻璃培养皿 (或者塑料皿,皿深1.5 cm)中,倒满配制好的食物,迅速平稳放置捆扎好的玻璃管,待食物冷却凝固。
    2.5
    从烧杯中取出监测管,擦净监测管外壁残余食物,用塑料塞封住食物端。
  3. 装配果蝇
    3.1
    用二氧化碳麻醉果蝇。
    注:由于二氧化碳麻醉会对果蝇产生不利影响,应尽量避免麻醉时间超过5 min。
    3.2
    用毛笔将果蝇移入监测管中 (一根监测管一只果蝇)。
    3.3
    将装入果蝇的监测管插入监测板中,并用带孔塑料塞 (或棉花塞) 封住非食物端。
    注:尽量将同一基因型同一性别的果蝇装在同一块监测板中,并准确记录果蝇基因型及其对应监测板号码和监测管位置。
    3.4
    待监测板上果蝇装配完成后,尽量使监测管中部 (无食物部分) 对准监测板上红外线发射/接收处,并用橡皮筋固定监测管,固定方法可参考图6A和图6B。


    图6. 玻璃管捆扎方法

    3.5
    将监测板放入预先设置好温度、湿度和时间参数的培养箱中,并用数据线 (美式标准) 将其与数据收集系统相连。 (例如8:00 a.m.开始,12 h光照/12 h黑暗,25 °C,湿度60%)
    3.6
    在电脑上打开数据收集软件DAMSystem,设置收集数据间隔为1 min并确认连接好的监测板已开始收集数据。
  4. 果蝇睡眠剥夺
    4.1
    预先设置好睡眠剥夺培养箱的温度、湿度和时间等参数。
    4.2
    根据实验需求,选择合适的时间点,将检测板放入混合仪中固定 (图7),并用数据线 (美式标准) 将其与数据收集系统相连,使睡眠剥夺时,可以同时检测果蝇的活动情况。


    图7. 检测板放置图

    4.3
    先接通混合仪电源,再接通单片机和继电器控制模块电源,睡眠剥夺实验即可开始。(例如8:00 a.m.开始,12 h光照/12 h黑暗的环境下,进行整夜睡眠剥夺。先进行两天的12 h光照/12 h黑暗检测,在第三天20:00 p.m.将检测板放入混合仪中固定,启动震荡系统后,于第四天8:00 a.m.结束震荡,将检测板放回培养箱中,连接数据收集系统,继续检测果蝇的活动情况。)
  5. 果蝇睡眠剥夺数据分析
    DAMSystem生成的数据为txt格式文件,可以被多种分析软件读取。参见网址:www.trikinetics.com/或本书中“高通量分析果蝇睡眠的实验方法”。本章节作者使用Matlab和Excel宏命令处理,可以联系作者通讯地址获取。

溶液配方

  1. 睡眠监测期间果蝇食物
    琼脂粉4.5 g
    蔗糖15 g
    丙酸1.85 ml
    双蒸水300 ml

致谢

感谢天猫商城telesky旗舰店、淘宝商城海森豪电子网络营销部,他们同意无偿公开产品部分技术说明,方便读者使用与参考。感谢童华威师兄在系统建立之初给予的帮助和指导。感谢国家自然科学基金项目 (31471031) 的支持。

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:金熙, 韩俊海. (2019). 基于单片机控制的果蝇睡眠剥夺方法. Bio-101: e1010298. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010298.
How to cite: Jin, X. and Han, J. H. (2019). Drosophila Sleep Deprivation System Based on Single Chip Control. Bio-101: e1010298. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010298.
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中宝 高
中国科学院生物物理研究所
可以调节混合器的震荡强度吗?
8/19/2019 3:23:32 AM Reply
俊海 韩

我们使用的混合器,可以通过调节震荡转子的转数(rpm),进而调节震荡强度。另外郭芳老师那边也有一套不错的装置,功能更丰富,建议了解一下。

8/20/2019 12:29:59 AM


俊海 韩

对不起,打错了字,是郭方老师。

8/20/2019 12:32:31 AM