摘要:肠道是机体最大的粘膜免疫层,也是病原和宿主相互斗争的最主要的场所。其中天然免疫应答是机体抵抗外界病原侵染的第一道防线。口服摄入,从而导致的胃肠道感染也是生物体最为普遍的病理模型。因此,建立卓有成效的肠道感染模式生物模型将对充分了解病原菌–宿主互作机制具有重要的意义。果蝇具有同高等动物高度保守的天然免疫通路,以及其他模式生物无法比拟的遗传学操作优势,因此赋予了果蝇被广泛应用于天然免疫的机理研究的能力。这里,我们将详细描述如何在果蝇的成体和幼体肠道中建立病原菌感染模型,以及相应的评价该模型体系的经典指标。
关键词: 肠道感染, 黑腹果蝇, Erwinia carotovora carotovora 15, Ecc15
材料与试剂
仪器设备
软件
实验步骤
本实验方案以革兰氏阴性的果蝇的非致死菌Erwinia carotovora carotovora 15 (Ecc15) 为例,建立果蝇肠道感染模型。该菌种来源于Dr. Won-jae Lee (Seoul National University) (Ryu等,2008)。
一、准备感染用的Ecc15溶液
二、准备实验用果蝇
三、准备无菌滤纸片 准备若干大小正好可以完全覆盖饲养管底部食物的滤纸片,高压灭菌。
四、果蝇成虫肠道感染
五、果蝇幼虫肠道感染
六、成虫生存率检测 从将果蝇成虫放入感染管中开始计时感染时间,感染后的果蝇成虫两天后转移到含新鲜培养基的饲养管中。对于致死能力比较低的细菌,可每一到两天记录死亡只数。对于致死能力强的细菌,可每小时到半天记录死亡只数。记录到所需天数后,采用GraphPad prism软件统计生存率并做曲线。计算方法:[100 × (总感染果蝇只数 − 各时间点累积死亡只数)/总感染果蝇只数] % = 生存率 (%) (Yang等,2018)。
七、果蝇天然免疫应答基因的检测 果蝇的天然免疫通路IMD通路是肠道中抵御革兰氏阴性菌的感染主要的免疫通路之一,同源于哺乳动物的NF-kB/TNFR通路,调控下游抗菌肽Antimicrobial Peptides (AMPs) 的表达,这些抗菌肽的表达水平反之可以用于检测IMD通路的活性 (Lemaitre和Hoffmann,2007)。常用于检测的AMPs有:Diptericin/Cecropin/Attacin。可在相应感染时间点,随机解剖30条成虫或幼虫的肠道作为一组提取全RNA,反转录成cDNA,荧光定量PCR检测相对表达量 (He等,2017)。
八、果蝇中病原菌载量的检测 在相应的感染时间点随机选取15只果蝇成虫或幼虫作为一组,用75%乙醇润洗果蝇2次,无菌水润洗2次。在冰浴的无菌PBS或LB培养基中,解剖出果蝇肠道,加200 μl无菌PBS或LB和少量无菌0.5 mm陶瓷研磨珠,震荡研磨果蝇肠道。将研磨得到的混合液梯度稀释,多选择10倍、100倍、1,000倍稀释。取稀释后的溶液100 μl均匀涂布在含相应抗生素的LB平板上,涂布三个平板作为三次平行对照,置于30 °C培养箱培养。约16 h后,计数板子上的菌落,根据公式计算CFU。 CFU/果蝇计算公式: 10倍稀释:三个平板菌落平均数 × 20/15 100倍稀释:三个平板菌落平均数 × 200/15 1,000倍稀释:三个平板菌落平均数 × 2,000/15 感染某时间点CFU/果蝇 = (CFU/果蝇10倍稀释 + CFU/果蝇100倍稀释 + CFU/果蝇1,000倍稀释)/3
结果与分析
一、果蝇成虫肠道感染结果分析
二、果蝇幼虫肠道感染结果分析 (图4) 果蝇幼虫肠道天然免疫通路的应答检测。 图4. 果蝇幼虫肠道感染3 h后抗菌肽Diptericin转录水平变化. 以内参基因RP49 (果蝇的核糖体RNA) 做相对定量,与阴性对照组相比,Ecc15感染组Diptericin转录水平有显著性差异。Ecc15感染组Diptericin转录水平显著高于阴性对照组。误差 (error bar) 均以Mean ± SEM显示,三次独立重复,n = 30,采用Student’s t-test方法统计两组样品之间显著性差异,*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns (not significant,不显著)。
溶液配方
致谢
感谢潘磊实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (31870887, 31570897–潘磊) 和中国科学院青年创新促进会优秀会员 (潘磊) 的支持。文中内容主要对实验室Nature Microbiology 2: 17056 (2017) 文章,进行了详细阐述。 作者贡献声明:褚珊珊完成大部分实验和图片采集,其中幼虫感染部分的实验和图片由赵娅娅提供。褚珊珊,潘磊撰写文章。
参考文献
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