摘要:天然免疫是宿主抵抗病原侵染的第一条防线。解析天然免疫的调控机制对于维持机体的生理健康和了解“宿主—病原”的共进化具有重要的研究意义。果蝇已被广泛证明是研究天然免疫的理想模式动物,源于其天然免疫体系完备,信号通路同高等动物高度保守 (Lemaitre和Hoffmann,2007;Vallet-Gely等,2008),且具有其他模式生物无法比拟的遗传操作优势。在这里,我们详细介绍一种构建果蝇感染模型的经典方式,即体表穿刺感染模型。穿刺损伤果蝇外骨骼将致病菌直接引入果蝇体腔,从而引发机体的系统性免疫应答。该模型也可以很好的模拟高等动物所面临的败血症感染。我们将在此介绍感染后生存率,病原菌增殖,天然免疫通路应答等评价该模型体系的经典指标。
关键词: 天然免疫, 果蝇, 穿刺感染
材料与试剂
仪器设备
软件
实验步骤
一、收集和准备实验用果蝇
二、培养和准备感染用细菌
三、感染用穿刺针的制备
四、穿刺感染
五、感染后生存率统计 感染后的果蝇应该每一天/两天转移到新的小管中。对于致死能力比较低的细菌,可每一到两天记录死亡只数。对于致死能力强的细菌,可每小时到半天记录死亡只数。记录到所需天数后,采用GraphPad prism画生存率曲线。 注:针刺半小时内死亡的果蝇,不计入生存率统计。有可能是是针扎不当,造成的快速死亡。
六、感染后果蝇RNA提取、cDNA反转录及Q-PCR检测
七、菌载量涂板检测 (CFUs)
结果与分析
一、生存率 (survival rate) 曲线绘制 利用公式:[100 × (总感染果蝇只数 − 各时间点累积死亡只数)/总感染果蝇只数] % = 生存率 (%),计算每个时间点生存率百分比,采用Graphpad软件绘制生存率曲线。对于每组数据含多条重复曲线,具体按如下步骤绘图:Grouped > Enter/Import data (Enter 3 replicates or more) > x轴输入时间点,y轴输入生存率,及组别名称 > 选取Plot summary data类别下的Superimposed symbol with connecting line, Plot mean with SEM > 生成曲线图,采用Multiple t-tests分析对照组和实验组各时间点显著性差异,如图2 (D,E),野生型果蝇W1118感染E. coli或S. typhimurium后生存率变化。对于每组数据只选取一条代表性曲线,按如下步骤绘图:survival >Enter/Import data >x轴输入时间点,y轴输入相应时间点死亡只数 >生成Kaplan-Meier生存率曲线;采用log-rank test方法比较两组曲线的显著性差异。 二、天然免疫应答检测 果蝇有两条主要的天然免疫应答通路,分别是多响应革兰氏阴性菌感染的IMD通路和响应革兰氏阳性菌和真菌感染的Toll通路。而其下游抗菌肽基因的转录表达水平,可用于衡量这两条天然免疫通路的应答活性,如:抗菌肽基因Diptericin、Drosocin、AttacinA、Attacin-D和Cecropin,多针对于IMD通路的应答,而抗菌肽基因Drosomycin、和Defensin多针对于Toll通路的应答。对于IMD pathway,一过性细菌感染初期,抗菌肽基因表达迅速升高,随着体内细菌被逐渐清除,抗菌肽基因表达逐渐降低至本底水平。但对于一些致病菌造成的持续感染过程,抗菌肽基因表达会长时间维持在高水平。如图2F、2G,野生型果蝇W1118在非致死性致病菌E. coli造成的一过性感染和致死性致病菌S. typhimurium造成的持续感染过程中,抗菌肽基因Diptericin转录水平变化。 三、感染后菌载量评价 感染过程中菌载量变化是评价机体免疫效能的一个重要指标,可以衡量宿主清除病原菌,以及病原菌增殖的情况。非致死性致病菌E. coli感染野生型果蝇后,会被机体持续清除,菌载量逐渐降低。而致死性致病菌S. typhimurium可在宿主细胞内持续增殖和传播,菌载量持续升高 (图2H、2I),机体最终死于菌毒血症。 图2. 穿刺感染后经典免疫指标的检测. A图,模式图展示胸和腹部穿刺感染。果蝇侧位摆放,胸部穿刺感染在前胸侧面,此处外壳较脆,钨丝针尖容易刺破。腹部穿刺感染在胸腹节连接处的稍微偏下位置,腹部外壳较柔软,操作相对困难,针尖容易损伤肠道。B、C和D图,对应A图,展示胸和腹部穿刺感染,沾有菌液的针尖穿刺位置在白色虚线圈内。E和F图,E. coli (OD600 = 200) 和S. typhimurium (OD600 = 10) 感染果蝇后生存率曲线,三次重复,error bar以Mean ± SEM显示,Multiple t-test统计各时间点显著性差异。G和H图,感染后不同时间点抗菌肽Diptericin转录水平变化,E. coli属于非致死性致病菌,随着菌逐渐被清除,免疫反应逐渐降低,而S. typhimurium是致死性致病菌,造成持续感染,免疫反应持续维持在最高水平。I和J图,E.coli和S. typhimurium感染后全身菌载量 (CFUs) 变化,Error bar均以Mean ± SEM显示,采用nonparametric t-test方法统计两个样品之间显著性差异。
溶液配方
致谢
感谢潘磊实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (31870887,31570897 –潘磊) 和中国科学院青年创新促进会优秀会员 (潘磊) 的资助。 作者贡献声明:王磊完成全部实验和图片采集。王磊,潘磊撰写文章。
参考文献
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