果蝇穿刺感染   

材料与试剂

1. 培养管
2. 钨丝
3. 铁制回形针
4. 96孔板
5. 0.5 mm瓷珠
6. 果蝇板
7. 培养板
8. 接种杆
9. 酒精灯
10. 羽化一周龄果蝇
11. 致病菌 (表1)
    
    表1. 本实验室常用穿刺感染致病菌及浓度
    
    *Erwinia carotovora carotovora 15 (Ecc15) 来自于Dr.Won-jae Lee实验室 (Seoul National University)；Listeria monocytogenes (10403S) 和S. typhimurium (SR-11) 均来自于刘志华实验室 (Institute of Biophysics, CAS)；Pseudomonas aeruginosa (PAO1) 来自于韩家淮实验室 (School of Life Sciences, Xiamen University); Micrococcus luteus (CIP A270) 来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC)。
    
    
12. 果蝇食物
13. 培养基 (LB和BHI培养基)
14. 抗菌肽引物
15. 70%商品化医用酒精
16. 无菌二次水 (DDW)
17. CO₂
18. NaCl
19. KCl
20. Na₂HPO₄
21. KH₂PO₄
22. 5 M KOH水溶液
23. Triton^TM X-100
24. TRIzol试剂 (ThermoFisher Scientific, Invitrogen^TM TRIzol^TM, catalog number: 15596026) 
25. mRNA反转录试剂盒 (abm, 5× All-In-One RT MasterMix, catalog number: G486) 
26. SYBGreen RT-PCR染料 (abm, 2× qPCR MasterMix, MasterMix-EL 4× 1.25 ml)
27. 1× PBS磷酸缓冲液 (见溶液配方)
28. 1× PBST (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 显微镜
2. 高压灭菌锅
3. -80 °C冰箱
4. 4 °C冰箱
5. 离心机
6. 涡旋仪 (Vortex)
7. 适配1.5 ml EP管的研磨震荡仪 (法国Bertin，Minilys)
8. 简易电解装置
9. 荧光定量PCR仪 (Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR仪)
10. 细菌培养箱(北京陆希科技有限公司，model: DHP9502A)
11. 果蝇恒温恒湿培养箱 (宁波江南仪器厂，HWS智能型；Percival公司，果蝇培养箱)
    

软件

1. GraphPad prism

实验步骤

一、收集和准备实验用果蝇

1. 果蝇饲养在恒温 (依据实验条件)，恒湿 (60%左右) 和12小时光照–12小时黑暗循环的培养箱中 (Greenspan，2004)。
2. 收集三天内新羽化果蝇，保证年龄接近，每小管食物随机分配15~25只果蝇，每两天换一次新鲜食物。再饲养3至4天，待年龄到一周可进行感染实验。每个品系每次感染，应至少准备60只果蝇。
   注：
   1)

   注意果蝇饲养环境的洁净、稳定。实验用果蝇要首先排除微孢子虫，Wolbachia细菌以及DCV，FHV等病毒的感染，这些病原的存在会极大干扰实验结果。
   2)

   新出生果蝇羽化五天后性成熟，各器官、系统生理过程运行稳定。并且肠道共生菌趋于稳定 (肠道共生菌会影响免疫应答) (Neckameyer和Argue，2013；Pais等，2018)。一般我们用雄性果蝇进行感染实验，雄性果蝇生理状态在两周内比较稳定。而雌性果蝇由于交配、进食、产卵等行为会显著影响生理状态，相比雄性免疫应答不稳定。
   
   

二、培养和准备感染用细菌

1. 感染前一到两天取出-80 °C冻存的菌液，划线涂板，在特定温度的培养箱中培养。长有单克隆的培养板可放置于4 °C冰箱，可供一周内感染实验使用。
2. 从培养板中挑取单克隆菌落，接种于含3~5 ml培养基的培养管中，置于特定温度的培养箱中培养 (静置或摇振取决于目的菌培养条件)。菌液生长至OD₆₀₀值介于0.6~0.8时停止培养 (通常3 h培养即可)，而后离心浓缩菌体 (一般采用转速6,500 × g (rcf)，离心时间3 min)。无菌1× PBS缓冲液清洗菌体两遍，最后用无菌1× PBS稀释菌体到特定的OD₆₀₀值。本实验室常用致病菌种类及穿刺感染浓度见表1。另外也可参考文献选择其它致病菌及浓度 (Neyen等，2014)。
   
   

三、感染用穿刺针的制备

1. 建议采用钨丝制备感染针，钨丝耐高温，耐化学腐蚀，硬度较硬，可长期反复使用。用剪刀截取一段长度约3 cm，直径约0.5 mm的钨丝，将钨丝缕直。组装简易电蚀装置制备钨丝针：将一个铁制回形针弯折成一端成半封闭圆环，一端垂直环平面的提勺状工具；电蚀装置的负极电钳夹住回形针竖直一端，正极电钳夹住钨丝针一端；负极末端半环水平浸没在5 M KOH水溶液中，接通电源，正极钨丝另一端垂直浸没在铁环液面中间，开始电解；控制钨针端部浸没的深度和电解时长，每电解2 s取出钨丝针在显微镜下观察钨丝尖电解程度，直至获得尖部直径约在0.2 mm的钨丝针，每根钨丝针的制备大概需要2到3分钟 (如图1A-1D)。电解方法也可参考姚琲等人 (2003)。
   
   
   图1. 穿刺用钨丝针的制备. A. 5 M氢氧化钾电解液，接种杆，用回形针弯折而成的提勺状半圆形电解环。B. 直流电简易电解装置，正极连接截断的钨丝 (约3厘米)，负极连接电解环。C. 在50毫升离心管盖中完成电解，电解环浸没于电解液中，钨丝上下垂直频繁浸没电解液，期间在显微镜下观察钨丝尖部尺寸是否满足穿刺需求 (尖部直径约0.22毫米)，继而停止电解。D. 制备好的钨丝针固定在接种杆，以备穿刺。
   
   

四、穿刺感染

1. 提前准备好穿刺用钨丝针，钨丝针固定到接种杆上，用70%酒精擦洗钨丝针，酒精挥发后置于酒精灯外焰上灼烧5 s至红色，冷却后可重复上述擦洗—灼烧步骤一到两次，保证钨丝针洁净，避免针尖携带的抗原对感染造成影响。
2. 实验用果蝇在通二氧化碳的果蝇板上麻醉，在显微镜下用毛刷摆正果蝇位置，即侧面向上 (如图2A-2C)。
3. 浓缩后菌液在Vortex上充分混匀，针尖蘸取菌液，在果蝇背部前胸旁侧位置穿刺，针尖需在伤口处停留约2秒钟。由于果蝇体腔处于负压状态，扎破的伤口处菌液会被自动吸入到血液中。同时对照组果蝇应用洁净的钨丝针蘸取无菌1× PBS穿刺。
4. 感染后果蝇分装到新的小管中，每管15~25只，每个品系果蝇每次感染至少两管重复，需至少三次重复感染。将果蝇置于特定温度的培养箱中 (多为29 °C)，用于记录死亡率，检测菌载量，和检测天然免疫通路的应答，如下游效应因子抗菌肽 (AMP) 的表达。
   注：
   1)

   针尖刺破背部外壳即可，不能刺入太深，以免损伤心脏。
   2)

   浓缩的菌液需放置于冰上，应该尽量缩短浓缩菌液和感染所用时间，最好在1小时以内。因为时间过久，菌体浓度及活性会出现显著改变。
   3)

   每穿刺一只果蝇，需重新蘸取菌液。每次针尖所蘸取菌液量应相近，即蘸取时间和在菌液中浸没深度保持一致。每感染3~5只果蝇后，用洁净纸擦拭针尖，并在酒精灯上灼烧。因为每次穿刺后都有菌液残留在针尖，针尖积累过多菌液会导致被感染果蝇所接受的初始菌含量不一致。同时需重新vortex混匀菌液，以免菌液沉降。
   4)

   穿刺的位置会影响果蝇的抗感染能力。前胸背部感染相对好操作，因为胸外壳较硬且脆，易刺破。而腹部感染则需要更精巧的操作，因为腹部较软，极易贯穿，造成体液外流，且易损伤其他器官如肠道，但肌肉层较薄，更容易将病原菌导入体腔 (Chambers等，2014)。 
   
   

五、感染后生存率统计
感染后的果蝇应该每一天/两天转移到新的小管中。对于致死能力比较低的细菌，可每一到两天记录死亡只数。对于致死能力强的细菌，可每小时到半天记录死亡只数。记录到所需天数后，采用GraphPad prism画生存率曲线。
注：针刺半小时内死亡的果蝇，不计入生存率统计。有可能是是针扎不当，造成的快速死亡。

六、感染后果蝇RNA提取、cDNA反转录及Q-PCR检测

1. 在感染后特定时间点，多检测特定的抗菌肽转录水平以评价天然免疫通路应答。对于IMD通路，可选择感染后0 h，6 h，12 h，和24小时时间点检测激活水平。对于Toll通路，多选择感染后0 h，12 h，24 h，和48 h时间点检测。每次实验每个时间点随机取5只果蝇放入1.5 ml EP管中，至少两个重复，加入冰上预冷的200 μl TRIzol试剂，外加3倍果蝇体积的瓷株 (0.5 mm)。置于小型研磨仪 (Minilys，最大转速，1 min) 充分研磨，研磨后再补加800 μl TRIzol至1 ml，上下颠倒混匀后立刻冻存于-80 °C，以备RNA提取。
2. 基于TRIzol的RNA提取方法参考文献 (参考文献9)，或选择试剂盒提取RNA。
3. 可选取2 μg RNA作为模板，总体积20 μl体系进行逆转录反应，获得的cDNA产物再补加180 μl无菌水进一步稀释，用于模板做后续RT-PCR检测。
4. 对于96孔板，取2 μl cDNA稀释液作为模板，检测抗菌肽相对转录水平，所使用引物见表2。
   注：一般IMD通路报告基因Diptericin在系统感染革兰氏阴性菌6小时后，转录水平达到最高水平。Toll通路的报告基因Drosomycin则在革兰氏阳性菌系统感染后约30 h转录水平到达最高水平。
   
   表2. 常用抗菌肽RT-PCR引物及序列
   
   
   

七、菌载量涂板检测 (CFUs)

1. 对于每个时间点，随机选取5只果蝇放入1.5 ml EP管中，冰上放置。加入1 ml 预冷70%酒精，Vortex震荡10 s，清洗果蝇表面残留的细菌，重复两次，此过程需快速操作，避免酒精对体腔内细菌杀伤。再用1 ml无菌水或1× PBS清洗两次，每次Vortex震荡10 s，洗去残留的酒精。清洗完毕，尽可能吸除EP管中残留的水或PBS。
2. 每管加入200 μl 无菌1× PBS，加三倍于果蝇体积的瓷珠 (0.5 mm)，充分研磨匀浆。补加800 μl 1× PBS至1 ml，10倍梯度稀释，取100~200 μl稀释液涂板。培养板放置于相应温度的培养箱过夜静置，第二天计数克隆数。在合适稀释倍数下，10 cm平板上生长的克隆，其数目应在300~800之间。
   注：
   1)

   避免研磨时间过久，研磨产热可能会失活细菌。
   2)

   新制备的固体培养板，水分较多，可取100 μl涂板。过夜放置的培养板水分减少，可取200 μl涂板。对于细胞外扩增细菌，研磨缓冲液用1× PBS即可。对于细胞内扩增细菌，如鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 和李斯特单胞菌 (Listeria monocytogenes)，需在PBS中添加0.1% Triton^TM X-100 (PBST) 以便更好的破裂细胞，释放胞内扩增的细菌。每个样品，应至少涂布两个不同浓度梯度的平板，统计平均数。
   3)

   CFUs归一到每只果蝇，采用对数或绝对值的科学记数法作为纵坐标画图，表示感染后特定时间点每只果蝇菌载量。

结果与分析

一、生存率 (survival rate) 曲线绘制
利用公式：[100 × (总感染果蝇只数 − 各时间点累积死亡只数)/总感染果蝇只数] % = 生存率 (%)，计算每个时间点生存率百分比，采用Graphpad软件绘制生存率曲线。对于每组数据含多条重复曲线，具体按如下步骤绘图：Grouped ＞ Enter/Import data (Enter 3 replicates or more) ＞ x轴输入时间点，y轴输入生存率，及组别名称 ＞ 选取Plot summary data类别下的Superimposed symbol with connecting line, Plot mean with SEM ＞ 生成曲线图，采用Multiple t-tests分析对照组和实验组各时间点显著性差异，如图2 (D，E)，野生型果蝇W¹¹¹⁸感染E. coli或S. typhimurium后生存率变化。对于每组数据只选取一条代表性曲线，按如下步骤绘图：survival ＞Enter/Import data ＞x轴输入时间点，y轴输入相应时间点死亡只数 ＞生成Kaplan-Meier生存率曲线；采用log-rank test方法比较两组曲线的显著性差异。

二、天然免疫应答检测
果蝇有两条主要的天然免疫应答通路，分别是多响应革兰氏阴性菌感染的IMD通路和响应革兰氏阳性菌和真菌感染的Toll通路。而其下游抗菌肽基因的转录表达水平，可用于衡量这两条天然免疫通路的应答活性，如：抗菌肽基因Diptericin、Drosocin、AttacinA、Attacin-D和Cecropin，多针对于IMD通路的应答，而抗菌肽基因Drosomycin、和Defensin多针对于Toll通路的应答。对于IMD pathway，一过性细菌感染初期，抗菌肽基因表达迅速升高,随着体内细菌被逐渐清除，抗菌肽基因表达逐渐降低至本底水平。但对于一些致病菌造成的持续感染过程，抗菌肽基因表达会长时间维持在高水平。如图2F、2G，野生型果蝇Ｗ¹¹¹⁸在非致死性致病菌E. coli造成的一过性感染和致死性致病菌S. typhimurium造成的持续感染过程中，抗菌肽基因Diptericin转录水平变化。

三、感染后菌载量评价
感染过程中菌载量变化是评价机体免疫效能的一个重要指标，可以衡量宿主清除病原菌，以及病原菌增殖的情况。非致死性致病菌E. coli感染野生型果蝇后，会被机体持续清除，菌载量逐渐降低。而致死性致病菌S. typhimurium可在宿主细胞内持续增殖和传播，菌载量持续升高 (图2H、2I)，机体最终死于菌毒血症。


图2. 穿刺感染后经典免疫指标的检测. A图，模式图展示胸和腹部穿刺感染。果蝇侧位摆放，胸部穿刺感染在前胸侧面，此处外壳较脆，钨丝针尖容易刺破。腹部穿刺感染在胸腹节连接处的稍微偏下位置，腹部外壳较柔软，操作相对困难，针尖容易损伤肠道。B、C和D图，对应A图，展示胸和腹部穿刺感染，沾有菌液的针尖穿刺位置在白色虚线圈内。E和F图，E. coli (OD₆₀₀ = 200) 和S. typhimurium (OD₆₀₀ = 10) 感染果蝇后生存率曲线，三次重复，error bar以Mean ± SEM显示，Multiple t-test统计各时间点显著性差异。G和H图，感染后不同时间点抗菌肽Diptericin转录水平变化，E. coli属于非致死性致病菌，随着菌逐渐被清除，免疫反应逐渐降低，而S. typhimurium是致死性致病菌，造成持续感染，免疫反应持续维持在最高水平。I和J图，E.coli和S. typhimurium感染后全身菌载量 (CFUs) 变化，Error bar均以Mean ± SEM显示，采用nonparametric t-test方法统计两个样品之间显著性差异。

溶液配方

1. 1× PBS磷酸缓冲液1 L
   8 g NaCl
   0.2 g KCl
   1.44 g Na₂HPO₄
   0.24 g KH₂PO₄
   用去离子二次水定容至1 L，用HCl和5 M NaOH调节pH值至7.4，121 °C高压灭菌20分钟
2. 1× PBST
   1× PBS
   0.1% Triton^TM X-100

致谢

感谢潘磊实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (31870887，31570897 –潘磊) 和中国科学院青年创新促进会优秀会员 (潘磊) 的资助。
作者贡献声明：王磊完成全部实验和图片采集。王磊，潘磊撰写文章。

参考文献

1. 姚琲，李春艳，刘平，王慧，杨梅 (2003). STM钨针尖电化学加工及其装置的改进. 电子显微学报 第22卷. (第3期): 256-258.
   
2. Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S. and Lazzaro, B. P. (2014). Thorax injury lowers resistance to infection in Drosophila melanogaster. Infect Immun 82(10): 4380-4389.
3. Greenspan, R. J. (2004). Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
4. Lemaitre, B. and Hoffmann, J. (2007). The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol 25: 697-743.
5. Neckameyer, W. S. and Argue, K. J. (2013). Comparative approaches to the study of physiology: Drosophila as a physiological tool. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 304(3): R177-188.
6. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O. and Lemaitre, B. (2014). Methods to study Drosophila immunity. Methods 68(1): 116-128.
7. Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M. and Teixeira, L. (2018). Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria. PLoS Biol 16(7): e2005710.
8. Vallet-Gely, I., Lemaitre, B. and Boccard, F. (2008). Bacterial strategies to overcome insect defences. Nat Rev Microbiol 6(4): 302-313., 302-313.
9. TRIZOL RNA isolation Protocol. https://medicine.yale.edu/keck/ycga/microarrays/protocols/TRIZOLRNAIsolation_092107_21453_284_10813_v1.pdf.