果蝇肠道组织免疫荧光染色   

材料与试剂

一、实验材料

1. 实验器具
   
   1)

   玻璃器皿
   量筒：1,000 ml，100 ml，50 ml
   蓝盖瓶：1,000 ml，250 ml，100 ml
   烧杯
   
   2)

   一次性耗材
   1.5 ml EP管
   50 ml离心管
   一次性枪头：1,000 μl，200 μl，100 μl，10 μl
   
   3)

   多道计时器
   4)

   解剖器具
   镊子 (DUMONT #5)
   解剖用塑料培养皿 (直径30 mm)
   5)

   载玻片：25 × 75 mm，厚度1.0 mm
   6)

   盖玻片：18 × 18 mm
   7)

   移液器：1,000 μl，200 μl，10 μl，2 μl (Eppendorf)
   
   

二、溶液与试剂

1. HCl
2. NaOH
3. NaCl
4. KCl
5. Na₂HPO₄
6. KH₂PO₄
7. Trition X-100 (Amresco)
8. 多聚甲醛 (PFA) (Sigma)
9. HEPES (Sigma)
10. 牛血清蛋白 (BSA) (Sigma)
11. 叠氮化钠
12. 甘油
13. DAPI (Beyotime)
14. 荧光标记的二抗
15. 1% Trition X-100 (见溶液配方)
16. 10%多聚甲醛 (PFA） (见溶液配方)
17. PBT (见溶液配方)
18. 1 M HEPES (见溶液配方)
19. 3%牛血清蛋白 (BSA) (见溶液配方)
20. 70%甘油 (GD) (见溶液配方)
21. 10%叠氮化钠 (见溶液配方)
22. 一抗工作液 (见溶液配方)
23. 二抗工作液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. MilliQ纯水仪 (Millipore)
2. 磁力搅拌器
3. 数显恒温水浴锅 (江苏金坛市亿通电子有限公司)
4. 医用低温保存箱-20 °C (海尔)
5. 医用冷藏箱4 °C (海尔)
6. 高压蒸汽灭菌器 (青岛胜方分析仪器有限公司，model: YXQ-LS-50SII)
7. 电子秤 (YUEPING)
8. pH计 (SANXIN, model: MP512)
9. 体式显微镜及冷光源 (AmScoPe, model: LG-150)
10. 斜摇床 (Kylin-Bell, model: TS-8)
11. 平摇床
12. 激光扫描共聚焦显微镜 (ZEISS)
    

实验步骤

一、第一天：解剖、固定、封闭

1. 在1× PBS中解剖出果蝇肠道，用镊子把解剖好的果蝇肠道转移到装有固定液的EP管中。
2. 果蝇肠道在固定液中固定20分钟 (放在斜摇床上摇动，转速10，保证样品不要沉在EP管底部)。
3. 吸弃固定液，加入500 μl 1× PBT润洗一次 (颠倒混匀三次即可)。
4. 吸弃PBT，再加入500 μl 1× PBT，放在平摇床上摇动，洗5分钟。
5. 吸弃PBT (确保全部吸干净)，加入200 μl 3% BSA，放在斜摇床上摇动，封闭1小时。
6. 吸弃3% BSA (确保全部吸干净)，加入200 μl目的抗体，即一抗，放在斜摇床上，转速10，4 °C过夜孵育。
   
   

二、第二天：孵育二抗

1. 回收一抗，加入500 μl 1× PBT润洗一次 (颠倒混匀三次即可)。
2. 吸弃PBT，再加入500 μl 1× PBT，放在平摇床上摇动，洗5分钟。
3. 吸弃PBT (确保全部吸干净)，加入200 μl二抗，放在斜摇床上摇动，室温避光孵育1.5小时~2小时 (时间不宜太长)。
4. 吸弃二抗，加入500 μl 1× PBT润洗一次 (颠倒混匀三次即可)。
5. 吸弃PBT，再加入500 μl 1× PBT，放在平摇床上摇动，洗5分钟。
6. 吸弃PBT (确保全部吸干净)，加入GD (约30~50 μl全部覆盖住样品即可)，放入-20 °C冰箱中保存。
7. 制片：用200 μl移液枪装配剪去约0.5 cm枪头，将样品吸到载玻片表面 (甘油不宜太多，甘油太多在共聚焦显微镜下观察时样品容易移动)，用镊子去除多余的果蝇表皮和其他组织，盖上载玻片。
8. 在激光扫描共聚焦显微镜下观察样品，并保存结果图 (如图1)。
   
   
   图1. 果蝇肠道免疫荧光染色图. 果蝇肠道细胞类型分为肠道干细胞 (ISC)、早期未分化细胞 (EB)、分泌细胞 (EE)、吸收细胞 (EC)，图中蓝色为DAPI标记细胞核，绿色为GFP标记ISC和EB细胞，红色为LacZ标记EB细胞。标尺：20 μm。
   
   

溶液配方

1. 固定液 (1 ml)
   

   1× PBS	500 μl
   1 M HEPES	100 μl
   10% PFA	400 μl

   混匀 (现用现配)
2. 1× PBS (pH = 7.4) (1,000 ml)
   
   1)

   称量8.0 g NaCl；0.2 g KCl；1.44 g Na₂HPO₄；0.24 g KH₂PO₄加入1,000 ml烧杯中
   2)

   加入800 ml纯水，把烧杯放在磁力搅拌器上不停搅拌，至完全溶解
   3)

   用HCl调pH值至7.4
   4)

   加纯水定容至1 L，倒入蓝口瓶中，在15 lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min。保存于室温
3. PBT (1× PBS + 0.1% Trition X-100) (1,000 ml)
   
   1)

   用1,000 ml量筒量取1,000 ml 1× PBS
   2)

   加入1 ml Trition X-100 (Amresco)，在磁力搅拌器上充分搅拌混匀
4. 10%多聚甲醛 (PFA) (100 ml)
   
   1)

   称量10 g PFA粉末 (Sigma)，加入到80 ml 1× PBS中
   2)

   再加入400 μl 10 M NaOH，放入60 °C水浴锅中至粉末完全溶解，期间摇匀2~3次
   3)

   将已溶解的PFA溶液取出放在室温，使其自然冷却至室温，用1× PBS定容至100 ml
   4)

   4 °C保存
5. 1 M HEPES (100 ml)
   
   1)

   称量23.83 g HEPES (Sigma) 加入到80 ml蒸馏水中
   2)

   完全溶解后加入10 M NaOH调pH至7.4
   3)

   加入蒸馏水定容至100 ml
   4)

   4 °C保存
6. 3%牛血清蛋白 (BSA) (50 ml)
   
   1)

   称量1.5 g BSA (Sigma) 溶于到30 ml 1× PBT中
   2)

   再加入1 ml 10%叠氮化钠
   3)

   用1× PBT定容至50 ml
7. 70%甘油 (GD) (100 ml)
   量取30 ml PBS和70 ml甘油，混匀，室温保存
   注：为防止荧光淬灭，可以考虑在70%甘油中加入适量的防荧光淬灭剂，-20°C避光保存。
   
8. 10%叠氮化钠 (100 ml)
   称量10 g叠氮化钠粉末溶于100 ml蒸馏水中, 4 °C保存
   
9. 一抗工作液
   
   1)

   用3% BSA稀释抗体，根据所用抗体说明书的要求按比例稀释
   2)

   4 °C保存；可重复使用
10. 二抗工作液 (1 ml)
    取1 ml PBT溶液，按比例加入DAPI (终浓度0.125 μg/ml)、荧光标记的二抗 (按说明书要求稀释)
    注：现用现配；DAPI和带荧光的二抗注意避光保存。
    

致谢

该实验方案改编自首都师范大学马梅芳硕士毕业论文 (2016)；使用该实验方案发表的文章：Li等，2013，2014；Ren等，2015；Ma等，2016。

参考文献

1. Li, Z., Zhang, Y., Han, L., Shi, L. and Lin, X. (2013). Trachea-derived dpp controls adult midgut homeostasis in Drosophila. Dev Cell 24(2): 133-143.
2. Li, Z., Guo, Y., Han, L., Zhang, Y., Shi, L., Huang, X. and Lin, X. (2014). Debra-mediated Ci degradation controls tissue homeostasis in Drosophila adult midgut. Stem Cell Reports 2(2): 135-144.
3.  Ren, W., Zhang, Y., Li, M., Wu, L., Wang, G., Baeg, G. H., You, J., Li, Z. and Lin, X. (2015). Windpipe controls Drosophila intestinal homeostasis by regulating JAK/STAT pathway via promoting receptor endocytosis and lysosomal degradation. PLoS Genet 11(4): e1005180.