Using Nano-injection to Prepare Models of DCV Infected Drosophila   

材料与试剂

1. 1.5 ml离心管 (Safe-Lock Tubes) (Eppendorf, catalog number: 0030120086)
2. 1 ml注射器
3. KIMTECH纸
4. 细胞培养皿
5. 0.5 mm无菌陶瓷研磨珠
6. 硼硅酸盐玻璃管 (3.5" Drummond #3-000-203-G/X 100 Replacement Tubes)
7. 96孔板
8. 果蝇培养管
9. 野生型雄性雌性果蝇成虫
10. Schneider果蝇培养基
11. 玉米粉
12. 酵母粉
13. 琼脂糖
14. 氯化钙
15. 蔗糖
16. 葡萄糖
17. 山梨酸钾
18. C₈H₈O₃
19. 10 mM Tris-HCl缓冲液, pH 7.2 
20. EDTA
21. SDS
22. 异丙醇 (Sigma, catalog number: I9516)
23. 70%酒精
24. 醋酸钾溶液
25. 无菌ddH₂O
26. 矿物油 (Sigma, catalog number: M8410-500ML)
27. PCR试剂盒 (TAKARA，catalog number: R011)
28. 10% FBS
29. 四环素 (Sigma, catalog number: 87128)
30. 四环素溶液 (见溶液配方)
31. 正常果蝇食物 (见溶液配方)
32. 溶液A (见溶液配方)

仪器设备

1. 解剖镊子
2. PCR仪 (ABI 2720 Thermal Cycler)
3. LEICA S6体视显微镜
4. -80 °C冰箱
5. 水浴锅
6. 昆虫细胞培养箱
7. 离心机 (Eppendof, model: 5424R)
8. 研磨机器 (Minilys personal homogenizer - Bertin Instruments)
9. 激光微电极拉制仪 (Sutter P-2000)
10. NANOJECT II (Drummond Scientific Company)
    

实验步骤

一、 DCV病毒的制备

果蝇C病毒 (DCV) 是一种单链正向无包膜的RNA病毒，类似于脊椎动物小RNA病毒，是模式生物果蝇中普遍存在的一种病毒 (Yang等，2018)。果蝇S2*细胞用于DCV增殖和滴定。S2* (S2 Star cell) 细胞系是从晚期果蝇胚胎的原代培养物中获得的 (Schneider，1972)。该细胞系可在无CO₂的室温条件下生长，在Schneider果蝇培养基中以单层半贴壁细胞或悬浮细胞的形式存在。健康细胞应大小均匀，呈圆形。

1. 感染前一天，用无抗生素的Schneider果蝇培养基 + 10% FBS将S2*细胞铺板于d = 10 cm细胞培养皿，密度为1 × 10⁷ cells/ml。
   将S2*细胞 (1 × 10⁵个/ml) 铺板于96孔板。在每孔加入细胞悬液100 μl。
   
   1.1

   用S2*细胞完全培养基将DCV病毒作连续10倍稀释 (10^-1~10^-10)。将稀释好的病毒接种到96孔板中，每一稀释度接种一纵排，共8孔，每孔接种50 μl (如图1所示)。
   注：果蝇DCV病毒产率通常在10⁸~10⁹ PFU/ml左右，稀释至少要覆盖在10^-5~10^-10范围内。
   
   1.2

   设正常细胞作为阴性对照 (100 μl细胞悬液 + 50 μl S2*细胞完全培养基)。
   
   1.3

   每天在显微镜下用20×或40×目镜的亮视野观察细胞状态，并记录每孔是否出现CPE。一般在第4 d会观察到CPE现象。将细胞外观模糊、培养基中出现碎片的孔，称为“阳性孔”，将细胞形态正常的孔，称为“阴性孔”。CPE阳性或阴性孔，分别用+或-标记 (如图1所示)。用Reed-Muench方法计算病毒TCID₅₀ (Reed和Muench，1938)。
   注：病毒相关实验所用的材料和手套均应放入指定废液缸中处理。
   
   1.4

   如果病毒不能达到所需的TCID₅₀ (视实验目的不同，可采用10²~10⁶ TCID₅₀单位的剂量进行病毒感染。通常，我们使用TCID₅₀为3 × 10⁶。)，解决方案如下：
   将100 ml病毒68,000 × g，4 °C 离心1 h。弃上清液，用1 ml Tris-HCl缓冲液 (10 mM, pH 7.2) 将其重悬。20 μl/管分装后存储在-80 °C。随机抽取5管，再次测定TCID₅₀病毒的平均水平。
   
   
   图1. CPE观察法评估病毒感染能力. 用S2*细胞完全培养基将DCV病毒作连续10倍稀释 (10^-1-10^-10)。将稀释好的病毒接种到铺有S2*细胞的96孔板中，每一稀释度接种一纵排，共8孔。每孔接种50 μl。设正常细胞作为阴性对照w/o (100 μl细胞悬液 + 50 μl S2*细胞完全培养基)。一般4d出现CPE。将细胞外观模糊、培养基中出现碎片的孔，称为“阳性孔”，将细胞形态正常的孔，称为“阴性孔”。CPE阳性或阴性孔，分别用+或-标记。
   
   
2. 感染当天将从-80 °C取出的DCV病毒置于25 °C水浴锅迅速融化。直接在步骤1.1准备好的含有S2*细胞的10 ml完全培养基中加入1 ml的DCV病毒溶液，MOI = 0.01。
3. 将细胞置于25 °C昆虫细胞培养箱中培养。感染3~5 d后，当细胞形态异常 (细胞形状模糊不清) 且培养基中充满黑色颗粒的细胞碎片时，准备收集病毒。
4. 将收集的含有DCV病毒的培养基置于-80 °C快速冷冻。随后将其取出，迅速置于25 °C水浴锅中快速融化。
5. 6,000 × g, 4 °C离心15分钟。
6. 将上清液收集在无菌的15 ml离心管中，旋涡震荡，以200 μl/管将DCV病毒分装于无菌的1.5 ml离心管中。
   注：病毒在4 °C可存放3~5 d。在-80 °C可存放一年。应避免反复冻融循环使用。
7. 随机选取5个含DCV病毒的离心管，用于病毒滴度测定。
   病毒在细胞内增殖，引起细胞产生型态上病变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、融合、死亡和脱落的现象称为细胞病变效应 (cytopathic effect; CPE) (Cotarelo等，1999)。对于DCV滴度的计算，采用CPE的方法。S2细胞按每孔1 × 10⁴个细胞铺在96孔板中，随后加入梯度稀释的DCV病毒液，在25 °C培养，第4 d观察CPE表型，并计算病毒滴度。
   
   

二、Wolbachia-free果蝇的制备
Wolbachia是一种通过母体传播的a-变形细菌。它可以感染大约40%的节肢动物。它也是实验室果蝇中常见的共生菌，它可以通过胞质不相容性影响宿主的生殖 (Teixeira等，2008；Bhattacharya等，2017；Chrostek等，2013；Ferguson等，2015；Hedges等，2008)。目前，有文献报道，Wolbachia对果蝇有抗病毒感染的作用 (Merkling等，2015)。因此，在以果蝇为模型，研究RNA病毒感染机制时，需要去除Wolbachia的影响，从而创造一个更单一和纯粹的背景，有利于病毒感染机制的研究 (Yang等，2018)。

1. 含四环素果蝇食物的制备
   每4 g新鲜果蝇食物中加入400 μl浓度为50 μg/ml的四环素溶液，充分混匀，并将食物在4 °C放置过夜。
   注：因四环素是用70%酒精配制，高浓度的酒精会影响果蝇的生育，因此食物配置后在4 °C放置过夜将起到有效挥发酒精的作用。
2. 第二天，将含有四环素的果蝇食物提前预热到室温。按20个雌性，10个雄性果蝇每管传到预热后的果蝇食物管中，按照正常的饲养条件进行培养，每3~4天传管一次。
   注：每一管食物中不能含有太多的卵，不然将降低四环素的效率。
   
3. 收集从四环素食物中新生长成的果蝇成虫 (3~5天之内)。并将这些成虫按照1~2的步骤在四环素食物中继续饲养，重复至少3代。基本上3代后，所生长出的果蝇将不含有Wolbachia。
4. Wolbachia的鉴定
   经过三代四环素处理后的果蝇成虫，随机收集5只果蝇进行Wolbachia的鉴定。
   
5. 在1.5 ml离心管中，装入5只雄果蝇。加入250 μl无菌ddH₂O以及0.5 mm的无菌陶瓷研磨珠，用研磨机器high speed研磨1分钟。加入250 μl 2×溶液A并震荡混匀。
   注：因溶液A中含有SDS，如果直接加入溶液A进行研磨，会产生大量的泡沫，从而影响研磨效果。如果为红眼果蝇，在研磨前去除头部，红眼色素会影响DNA产物的颜色。
   
6. 加入190 μl 5M醋酸钾溶液，震荡混匀，冰浴15分钟。
7. 室温离心13,000 × g，5分钟，收集上清并转移至新的1.5 ml离心管。
8. 重复步骤2~7。
9. 加入750 μl异丙醇，轻柔地上下颠倒几次，室温孵育5分钟。
10. 室温离心13,000 × g，5分钟，去除上清，底部白色沉淀为基因组DNA。
11. 加入1 ml 70%酒精，上下颠倒几次，清洗基因组DNA，室温离心13,000 × g，5分钟，去除上清。
12. 风干直至基因组DNA呈透明状。
13. 用100 μl无菌ddH₂O重悬DNA，并检测浓度，将DNA浓度稀释至100 ng/μl。
14. 取200 ng DNA作为模板，用Wolbachia特异性引物进行PCR鉴定。PCR程序：第一步：95 °C，15 min；第二步：95 °C，45 s；第三步：50 °C，45 s；第四步：72 °C，1 min；第二至第四步循环36次；第五步：72 °C,延伸10 min。
15. 用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定Wolbachia 16S rRNA (200 bp) 以及wsp (600 bp) 特异性条带。引物信息如下：
    
    
    
16. 将去除了Wolbachia的果蝇在正常果蝇食物上进行保种。Wolbachia-free的果蝇生长发育正常，可长期保种。建议定期检测是否存在二次污染。
    
    

三、Pastrel基因分型
果蝇的基因型背景会影响果蝇的抗病毒反应。最显著的是位于果蝇3号染色体上的基因pastrel (pst) 在512位点发生SNP (Single Nucleotide Polymorphism)时产生的R (Resistance) allele与S (susceptible) allele可改变果蝇对DCV病毒感染的易感性 (Cao等，2017；Magwire等，2012)。在构建果蝇DCV病毒感染模型时，应调整目标果蝇位于同样的遗传背景之下。例如：可以用梯度PCR快速检测Pastrel基因的分型。

1. 提取果蝇基因组DNA (步骤二中5~13)。
2. 以100 ng DNA为模板，20 μl反应体系。引物512C与512T分别用来检测R等位基因与S等位基因。PCR程序：第一步：95 °C，15 min；第二步：95 °C，45 s；第三步：梯度退火温度设定，梯度如下：54 °C，54.7 °C，55.5 °C，58 °C，59.7 °C，62.2 °C，63.7 °C，64 °C，45 s；第四步：72 °C，1 min；第二至第四步循环30次；第五步：72 °C,延伸10 min。
3. 用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定512C与512T (均为100 bp) 特异性条带。引物信息如下：
   
   
   

四、果蝇DCV感染以及死亡率分析
Nano-injection注射方法操作简单，定量重复性好，可用于筛选参与病毒-宿主相互作用的宿主/病毒因子，进而深入阐述先天免疫信号通路与其他生物通路在病毒感染反应中的相互作用 (Merkling等，2015；Yang等，2018)。

1. 拉针：Sutter P-2000 激光微电极拉制仪通过二氧化碳激光对硼硅酸盐玻璃管 (3.5'' Drummond #3-000-203-G/X 100 Replacement Tubes) 进行加热，用电动滑臂来固定玻璃管并将其拉伸，操作界面可以进行加热和拉伸相关参数的设定：HEAT：600 °C；FILAMENT：3；VELOCITY：15；DELAY：200；PULL：200。
   注：拉针的各个参数受温度与湿度的影响较大，需根据实验室的环境优化最佳参数。
   
2. 开针：在LEICA S6体视显微镜4×目镜下用解剖镊子将毛细管拉制而成的针前端夹断，尖端直径约0.05 mm最佳 (如图2所示)。
   注：开针部分直径不易过大，且在注射过程中避免碰触针尖，以免针尖断裂。
   
   
   图2. 开针. 用解剖镊子将毛细管拉制而成的针前端夹断。
   
   
3. 装针
   
   3.1

   清洁仪器注射头：首先，拧下黑色盖帽，取出黑色橡胶圈和白色橡胶圈 (如图3所示)。随后用KIMTECH纸将残留在上面的矿物油擦干净。
   
   
   图3. NANOJECT II仪器注射头内各部件展示图. 从左到右依次为黑色盖帽，起密封左右的黑色橡胶圈A，有大小孔径的白色橡胶圈B与黑色橡胶圈C。
   
   
   3.2

   取一支1 ml注射器，吸取专用矿物油，从注射针后部将矿物油灌入注射针，灌满，无气泡。
   3.3

   首先将黑色橡胶圈A套在注射头的金属活塞上，接着将黑色橡胶圈B从灌满矿物油的微针后部套上，孔径大的一侧和针末端平齐，随后将白色橡胶圈B孔径大的一侧与黑色橡胶圈B紧贴，最后将针插入注射头，拧上盖帽。(如图4所示)
   
   
   图4. 装针示意图. 黑色橡胶圈A，有大小孔径的白色橡胶圈B与黑色橡胶圈C的依次顺序如图所示。
   
   
   3.4

   按住控制器的empty键，令注射头的金属活塞进入针内可见区域1~1.5 cm，从而将矿物油打出一部分，用KIMTECH纸擦净针尖端的油滴。
   3.5

   将针尖端浸入待注射的液体，按住full键吸入注射液，直到注射头的金属活塞刚刚退回机器注射头内。
4. 挑选注射用的果蝇：果蝇羽化后，挑选所需的雄性果蝇60~100只置于fly-pad上，CO₂麻醉后，开始定量显微注射。
5. 果蝇感染：调节旋钮使针尖端插入果蝇intra-thoracic (如图5所示)。注射时针插入的位点为果蝇胸部mesopleura与pteropleura之间。插入的深度约2 mm。按下inject键一次 (njection的速度设置为slow)，提示音响起，直到机器停止振动，一次注射结束。正确注射后，可以观察到果蝇的口器伸出。每只果蝇注射50.6 nl稀释好的病毒稀释液(100 PFU/fly)。病毒稀释的方法如步骤一中1.2所述，用PBS梯度稀释，全程冰上操作。注射PBS的果蝇作为空白对照组。每次独立实验至少注射3管 (20只雄果蝇/管)，做为组内平行对照。严格记录注射时间。
   
   
   图5. Nano-injection注射方法构建DCV果蝇感染模型
   注：不要在注射过程中断电或切断控制器和注射仪的电线连接，这会对仪器精密度造成损伤。注意观察注射液的存量，防止将矿物油注射入果蝇体内。
   
   
6. 注射后，小心地将果蝇收回果蝇管中。在果蝇苏醒之前保持果蝇管水平放置，以免麻醉的果蝇被食物粘死，出现死亡率分析中的假阳性。准确记录果蝇感染时间。
7. 果蝇死亡率分析：当果蝇完全苏醒后，将果蝇管直立放置于25 °C培养箱中培养。每日对其观察，并计算死亡率。每天同样时间将果蝇换至含新鲜食物的培养管中，并记录死亡数目。最后使用Kaplan-Meier survival curves分析死亡率。
   注：由于注射需要时间 (如果技术熟练，一般每小时可注射100只果蝇)，而且DCV复制非常快，所以每次注射完20只果蝇后，在试管上写下准确的注射时间是非常重要的。其次，要严格设置空白对照。最后，果蝇的性别对实验结果影响较大。通常情况下，本课题组会挑取成年雄性果蝇做实验。因为，与雌性果蝇相比，雄性果蝇受体内产生的激素变化影响较小 (Schwenke和Lazzaro，2017)。因此，用雄性果蝇做实验，实验结果稳定，可重复性高。另外，注射0.5 h之内死亡果蝇，一般不计入死亡率的统计，以避免可能是由于注射针穿刺所造成的创伤死亡。
   
8. 感染后果蝇体内DCV病毒PFU测定。根据本组已发表数据 (Yang等，2018)，DCV感染果蝇后，dcv mRNA水平表达量与果蝇体内病毒PFU呈正相关关系。当病毒感染量为100 PFU/ml时，通过Realtime PCR检测DCV感染后3 d与6 d果蝇体内dcv mRNA 水平表达量 (表1)，进而可推算出DCV感染后3 d与6 d Ore^r果蝇体内PFU。
9. Dcr2/RNAi与JAK/STAT抗病毒天然免疫通路的检测。果蝇的抗病毒天然免疫机制主要包括RNAi与Jak-STAT通路 (Xu和Cherry，2014) 其激活的报告基因分别为vago基因与vir-1基因。当病毒感染量为100 PFU/ml时，通过Realtime PCR检测DCV感染后0 d，3 d与6 d Ore^r果蝇体内vago与vir-1 mRNA水平表达量 (表1)。
   
   表1. 检测rp 49, dcv, vago及vir-1基因表达水平所用到的引物信息
   
   

结果与分析

1. 滴度测定
   
   
   图6. 显微镜下观察S2*细胞CPE状态. S2*细胞按每孔1 × 10⁵个的数铺在96孔板中，随后加入梯度稀释的DCV病毒液 (图C)，在25 °C培养4 d后，在加有DCV病毒稀释液的细胞孔中可观察到CPE表型 (图A中，如白色箭头所示，培养基中有大量细胞碎片)；没有加入DCV病毒液的细胞孔中细胞状态正常 (图B)。对于DCV滴度的计算，采用CPE的方法。用Reed-Muench方法计算病毒TCID₅₀，计算得病毒滴度：1 Unit TCID₅₀ = 4.29 × 10⁹ (3 × 10⁹ PFU/ml)。
   
   
2. Wol-free检测
   
   
   图7. 经三代四环素处理可获得Wolbachia-free果蝇. 果蝇体内存留的Wolbachia会导致果蝇对DCV不易感。G1, G2与 G3 分别代表Ore^r flies (Bloomington 5) 被四环素处理1代，2代与3代后的果蝇。经过三代四环素处理的果蝇基因组中均检测不到wol-16s rRNA 与 wsp 特异性序列。
   
   
3. Pastrel基因分型
   
   
   图8. 梯度PCR鉴定pst基因分析. 引物512C与512T分别用来检测果蝇成虫中R等位基因与S等位基因。T_m梯度分别为 1: 54 °C, 2: 54.7 °C, 3: 55.5 °C, 4: 58 °C, 5: 59.7 °C, 6: 62.2 °C, 7: 63.7 °C, 8: 64 °C。
   
   
4. 死亡率分析
   
   
   图9. DCV感染后后果蝇的存活率分析. 与野生型Ore^r果蝇相比，Ore^r-wol free对DCV更易感。圆圈与方框分别代表Ore^r flies与Ore^r-wol free被DCV感染后14 d内的存活率。图中error bars分别表示standard error (s.e.); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, ns, not significant。
   
   
5. DCV感染后果蝇体内PFU测定
   
   
   图10. DCV感染的Orer果蝇体内PFU测定. 病毒感染量为100 PFU/ml。通过Real-time PCR检测DCV感染后3 d与6 d Ore^r果蝇体内dcv基因mRNA水平表达量。根据本组已发表数据 (Yang等，2018)，DCV感染果蝇后，dcv基因mRNA水平表达量与果蝇体内病毒PFU呈正相关关系 (B)，进而可推算出DCV感染后3 d与6 d Ore^r果蝇体内PFU。
   
   
6. Dcr2/RNAi与JAK/STAT抗病毒天然免疫通路的检测
   
   
   图11. DCV感染的Ore^r果蝇体内Dcr2/RNAi与JAK/STAT抗病毒天然免疫通路均被激活. 病毒感染量为100 PFU/ml。通过Real time PCR检测DCV感染后0 d与3 d Ore^r果蝇体内Dcr2/RNAi与JAK/STAT抗病毒天然免疫通路报告基因vago与vir-1 mRNA水平表达量。
   

溶液配方

1. 四环素溶液 (50 μg/ml)
   溶于70%的酒精中，终浓度为50 μg/ml
   
2. 正常果蝇食物
   每1 L食物含77.7 g玉米粉，32.19 g酵母粉，10.6 g琼脂糖，0.726 g氯化钙，31.62 g蔗糖，63.3 g葡萄糖，2 g山梨酸钾，15 ml 5% C₈H₈O₃ (溶于无水乙醇)
3. 溶液A
   0.2 M Tris-HCl, pH 9.0
   0.2 M EDTA
   2% SDS
   

致谢

感谢潘磊实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (31870887，31570897 –潘磊)、(31670909–俞珺璟) 和中国科学院青年创新促进会优秀会员 (潘磊) 的支持。本文实验方案改编自本实验室发表的文章J. Vis. Exp., doi:10.3791/58845 (2018) 和 J Virol 92(18) (2018)。
作者贡献声明：赵娅娅和俞珺璟完成全部实验和图片采集。赵娅娅，俞珺璟和潘磊撰写文章。

参考文献

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