摘要:病毒是引发重大流行性传染病的源头之一。因此,深入解析病毒与宿主的相互作用,对于了解病毒的致病机理,进而寻找最优抗病毒方案具有重要的理论意义和实际应用价值。黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster) 源于其同高等动物高度保守的天然免疫信号通路和其他模式生物无法比拟的遗传操作优势,已经被广泛应用于病原体和宿主的互作研究之中。特别是,对于虫媒传播的RNA病毒,果蝇已被证明是理想的宿主模式动物,发现了大量的保守的抗病毒天然免疫机制。本文将以DCV病毒为范例,详细描述如何通过定量显微注射的方法构建果蝇的病毒感染模型,并介绍评价该模型体系的经典指标和必须加以考虑的注意事项。
关键词: 果蝇, DCV, Wolbachia, Nano-injection
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
一、 DCV病毒的制备
果蝇C病毒 (DCV) 是一种单链正向无包膜的RNA病毒,类似于脊椎动物小RNA病毒,是模式生物果蝇中普遍存在的一种病毒 (Yang等,2018)。果蝇S2*细胞用于DCV增殖和滴定。S2* (S2 Star cell) 细胞系是从晚期果蝇胚胎的原代培养物中获得的 (Schneider,1972)。该细胞系可在无CO2的室温条件下生长,在Schneider果蝇培养基中以单层半贴壁细胞或悬浮细胞的形式存在。健康细胞应大小均匀,呈圆形。
二、Wolbachia-free果蝇的制备 Wolbachia是一种通过母体传播的a-变形细菌。它可以感染大约40%的节肢动物。它也是实验室果蝇中常见的共生菌,它可以通过胞质不相容性影响宿主的生殖 (Teixeira等,2008;Bhattacharya等,2017;Chrostek等,2013;Ferguson等,2015;Hedges等,2008)。目前,有文献报道,Wolbachia对果蝇有抗病毒感染的作用 (Merkling等,2015)。因此,在以果蝇为模型,研究RNA病毒感染机制时,需要去除Wolbachia的影响,从而创造一个更单一和纯粹的背景,有利于病毒感染机制的研究 (Yang等,2018)。
三、Pastrel基因分型 果蝇的基因型背景会影响果蝇的抗病毒反应。最显著的是位于果蝇3号染色体上的基因pastrel (pst) 在512位点发生SNP (Single Nucleotide Polymorphism)时产生的R (Resistance) allele与S (susceptible) allele可改变果蝇对DCV病毒感染的易感性 (Cao等,2017;Magwire等,2012)。在构建果蝇DCV病毒感染模型时,应调整目标果蝇位于同样的遗传背景之下。例如:可以用梯度PCR快速检测Pastrel基因的分型。
四、果蝇DCV感染以及死亡率分析 Nano-injection注射方法操作简单,定量重复性好,可用于筛选参与病毒-宿主相互作用的宿主/病毒因子,进而深入阐述先天免疫信号通路与其他生物通路在病毒感染反应中的相互作用 (Merkling等,2015;Yang等,2018)。
结果与分析
溶液配方
致谢
感谢潘磊实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (31870887,31570897 –潘磊)、(31670909–俞珺璟) 和中国科学院青年创新促进会优秀会员 (潘磊) 的支持。本文实验方案改编自本实验室发表的文章J. Vis. Exp., doi:10.3791/58845 (2018) 和 J Virol 92(18) (2018)。 作者贡献声明:赵娅娅和俞珺璟完成全部实验和图片采集。赵娅娅,俞珺璟和潘磊撰写文章。
参考文献
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