果蝇肠道损伤检测方法--蓝精灵实验   

材料与试剂

1. 0.22 μm滤膜 (Millipore，SLGV033RB)
2. 滤纸
3. 成虫果蝇或三龄幼虫
4. Sucrose (Sigma, catalog number: S0389)
5. 可食用蓝色染料 (Care^TM亮蓝特浓级85%，OC BB 85%)
6. DSS (MP，160110)
7. 5%蔗糖溶液 (见溶液配方)
8. Smurf染料溶液 (见溶液配方)
9. 5% DSS溶液 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 体视镜 (Leica，S6)

实验步骤

1. 配制指示溶剂，将可食用蓝色染料以2.5% (质量体积比) 溶于5%的蔗糖溶液，并用0.22 μm滤膜过滤后无菌保存。
2. 将双层圆形滤纸片塞入装有食物的饲养管中，完全覆盖食物，吸取200 μl指示溶剂，均匀的悬滴于滤纸片上，等滤纸片吸干溶剂后，再吸取200 μl指示溶剂，二次均匀滴加在滤纸片上，静置 (滤纸被浸润至饱和但不会有多余液体溢出为准)。
3. 将待检测的成虫果蝇先用CO₂麻醉，每挑选20只，放入一个饲养管中。将饲养管横放，用刷子先将果蝇轻轻刷到管壁上，等果蝇完全苏醒后，再将饲养管慢慢竖放。
4. 在该果蝇管中饲喂9~12个小时后在镜下观察smurf的情况，如果只有口器至消化道呈现蓝色者判定为肠道未出现渗漏；如果除口器至消化道之外腹腔、胸腔、头部等部位出现蓝色则判定为肠道出现渗漏，说明果蝇肠道结构发生变化出现严重损伤。
5. 因肠道出现渗漏后，蓝色染料浸满全身，果蝇形似蓝精灵，因此，此实验命名为蓝精灵实验，实验结果以呈现蓝精灵果蝇的数目除以总数目乘以100%，以指征肠道渗漏果蝇的比例数。对于同一种基因型果蝇的同样处理，至少需要三管作为平行实验，且至少需要三次独立实验重复。
   

注意事项

成虫果蝇可以提前饥饿脱水2小时，再喂食染料，将会极大提高摄入率和缩短观察时间。但对于有些生理病理缺陷的果蝇，长时间饥饿脱水处理可能会造成部分果蝇死亡。

结果与分析

正常果蝇肠道壁完整，饲喂可食用蓝色染料后，染料将集中于果蝇的口器、前胃及肠道中。我们以Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) 饲喂后的果蝇为阳性对照。DSS可对肠道基底层造成损伤 (主要成分为胶原蛋白IV)，使得肠道壁变薄，肠道组织出现损伤。也因此DSS常被用来作为诱导肠炎模型的药物 (Amcheslavsky等，2009)。给果蝇高剂量长时间饲喂DSS引发的果蝇死亡率增加，也是由肠道损伤引起的。果蝇中常用DSS诱导肠道损伤作为研究肠道干细胞修复的模型 (Amcheslavsky等，2009)。因此，蓝精灵实验可以指示果蝇在DSS诱导下肠道渗漏的现象。DSS诱导肠道损伤的果蝇在饲喂可食用蓝色染料后，不仅在口器、前胃及肠道中滞留有蓝色染料，在果蝇的整个腹腔，甚至胸腔及头部都会出现蓝色染料。同理，在幼虫时期也可以使用该方法来指征果蝇肠道的完整性 (He等，2017) (图1)。


图1. 果蝇蓝精灵实验. 3龄幼虫饲喂5% DSS 24小时后，大约有20%的幼虫可检测到肠道渗漏 (图A与图B对照)；成虫饲喂5% DSS 48小时后，大约有40%的成虫可检测到肠道渗漏 (图C与图D对照)。E图为统计数据。

溶液配方

1. 5%蔗糖溶液
   称取5 g蔗糖溶于100 ml ddH₂O，并用0.22 μm的滤膜过滤后无菌保存
2. Smurf染料溶液
   称取2.5 g可食用蓝色染料，溶于100 ml 5%蔗糖溶液中，并用0.22 μm的滤膜过滤后无菌保存
3. 5% DSS溶液
   0.5 g DSS溶于10 ml 5%无菌蔗糖溶液中
   

致谢

感谢潘磊实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (31870887，31570897–潘磊)、(31670909–俞珺璟) 和中国科学院青年创新促进会优秀会员 (潘磊)的支持。本文实验方案改编自本实验室已发表的文章Nat Microbiol. 2017 Apr 18; 2:17056. doi: 10.1038/nmicrobiol.2017.56.
作者贡献声明：俞珺璟和杨烁完成全部实验和图片采集。俞珺璟和潘磊撰写文章。

参考文献

1. Amcheslavsky, A., Jiang, J. and Ip, Y. T. (2009). Tissue damage-induced intestinal stem cell division in Drosophila. Cell Stem Cell 4(1): 49-61.
2. He, X., Yu, J., Wang, M., Cheng, Y., Han, Y., Yang, S., Shi, G., Sun, L., Fang, Y., Gong, S. T., Wang, Z., Fu, Y. X., Pan, L. and Tang, H. (2017). Bap180/Baf180 is required to maintain homeostasis of intestinal innate immune response in Drosophila and mice. Nat Microbiol 2: 17056.
3. Rera, M., Clark, R. I. and Walker, D. W. (2012). Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A 109(52): 21528-21533.