不同发育时期果蝇样品的收集   

How to cite Favorites Q&A Share your feedback Cited by

Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

 

摘要:果蝇发育主要有卵、幼虫、蛹和成虫几个发育阶段,主要讲述如何快速有效地收集这几个不同时期样本。

关键词: 果蝇, 发育时期, 样品收集

材料与试剂

  1. 1.5 ml离心管
  2. 博格利诺勾线笔
  3. Kimwipes纸巾 (Kimberly-Clark Worldwide, catalog number: 34155)
  4. 100 μm细胞滤网筛 (Corning Incorporated-Life Sciences, catalog number: 352360)
  5. 高糖型马利活性干酵母 (英联马利(北京)食品销售有限公司)
  6. 苹果汁
  7. 84消毒液
  8. PBS
  9. CO2
  10. 琼脂
  11. 食物平板 (见溶液配方)
  12. 酵母泥 (见溶液配方)
  13. 苹果汁板 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 果蝇培养瓶 (Genesee Scientific, catalog number: 32-130)
  2. 果蝇胚胎收集笼 (Genesee Scientific, catalog number: 59-101)
  3. 果蝇培养箱 (Percival Scientific, model: DR-41VL)
  4. 离心机 (Eppendorf)
  5. 微波炉

实验步骤

一、 果蝇卵的收集

  1. 果蝇培养条件:温度25 °C;湿度60%。准备4个果蝇培养瓶,每个培养瓶里各放50只雄果蝇和50只雌果蝇。
  2. 3天后,倒掉果蝇,每个培养瓶放一张kimwipes纸巾,增加蛹依附的空间,以收到更多的成虫。
  3. 第10天开始下一代成虫开始出,收集3天的成虫,并全部 (约1,200只果蝇) 集中放到果蝇胚胎收集笼中养2天,使用直径为10 cm的食物平板。为减少果蝇的损耗,把胚胎收集笼倒置,让食物平板在上,并放入2张kimwipes纸巾以保持环境干燥。
  4. 第3天更换新鲜的食物平板,并在食物平板上抹适量酵母,放入果蝇胚胎收集笼中适应一天,胚胎收集笼倒置,食物平板在上,更换2张新的kimwipes纸巾。
  5. 将苹果汁板上抹上酵母泥,苹果汁板在下面,每间隔1 h更换一次苹果汁板,换2~3次苹果汁板之后观察预产情况,卵数量足够即可开始收集。
  6. 用博格利诺勾线笔将苹果汁板上的卵收集到100 μm的细胞滤网筛中。
  7. 用自来水冲洗一遍。
    注:自来水的流速不能太大,并且避免直接冲洗卵,减少对卵的伤害。
  8. 用干纸巾吸干水分后,置于50% 84消毒液中漂洗1 min。
    注:50% 84消毒液处理的作用是去掉外层卵膜 (outer chorion)。
  9. 自来水冲洗1 min,注意水的流速不要太快。
  10. 洗干净的卵即可用于下一步实验。
    注:根据预期收集的胚胎发育时期,可以调整产卵笼下苹果汁板的更换间隙,并放置一定时间再收集胚胎。如:产卵笼下苹果汁板放置4小时使成虫产卵,取出后把平板在培养箱中放置12小时再收集,则得到的胚胎发育时期为12~16小时。

二、 果蝇幼虫、蛹及成虫的收集
  1. 准备3~5天的150只处女果蝇和200只雄果蝇,平均分到10个管里。
    注:食物上添加酵母,促进果蝇产卵,25 °C,60%湿度保证最佳培养条件。
  2. 每间隔4 h将果蝇转移至新的食物管中开始新的一轮实验计时,以4 h为一个时间段,收集对应时间段的幼虫。
  3. 24 h收第1龄的幼虫,48 h~72 h收第2龄的幼虫76 h~80 h收第3龄早期幼虫,96 h收第3龄中期幼虫,116 h收第3龄晚期幼虫,6天收早期的蛹,7天收中期的蛹,8天收晚期的蛹,9天收隐成虫,10天收成虫。每个时间点的果蝇参考下图1。


    图1. 不同发育时期果蝇形态 

  4. 收集不同时期的幼虫
    4.1
    搅碎食物,小心将幼虫转移到1.5 ml离心管中。
    4.2
    10,000 rpm室温离心5 min,幼虫会在上层,将其转移至干净的离心管中。
    4.3
    加入1 ml 1× PBS,10,000 rpm室温离心5 min,弃掉PBS。
    4.4
    如果是要做RNA相关实验,就可以加入Trizol进行处理。
    注:收集一龄幼虫也可以用收集胚胎的方法。洗净即可,不必用84消毒液处理。
  5. 收集不同时期的蛹
    5.1
    用博格利诺勾线笔小心将蛹夹出果蝇管,收集至1.5 ml离心管中。
    5.2
    10,000 rpm室温离心5 min,蛹会在上层,将其转移至干净的离心管中。
    5.3
    加入1 ml 1× PBS,10,000 rpm室温离心5 min,弃掉PBS。
    5.4
    如果是要做RNA相关实验,就可以加入Trizol进行处理。
  6. 收集成虫
    将果蝇用CO2麻醉后收集即可。

结果与分析

如果收到的卵不够或者很少,可以从两个方面是找原因:

  1. 果蝇是否都是3~7天的果蝇。
  2. 果蝇的密度一定要合适,太少肯定产卵少,太多果蝇状态很差,会粘死很多,也会导致卵少。

溶液配方

  1. 食物平板
    在10 cm平板中倒入1/2高度的果蝇食物,冷却即可
  2. 酵母泥
    5 g高糖型马利活性干酵母中加入8 ml双蒸水,搅拌混匀
  3. 苹果汁板
    1)
    200 ml双蒸水和100 ml的苹果汁混匀,加入6 g琼脂,摇匀
    2)
    微波炉加热至琼脂完全融化,倒入10 cm平板,冷却即可
    3)
    4 °C倒置保存
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:邓娟, 刘南. (2019). 不同发育时期果蝇样品的收集. Bio-101: e1010252. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010252.
How to cite: Deng, J and Liu, N. (2019). Collection of Drosophila Samples at Different Developmental Stages. Bio-101: e1010252. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010252.
Q&A

Please login to post your questions/comments. Your questions will be directed to the authors of the protocol. The authors will be requested to answer your questions at their earliest convenience. Once your questions are answered, you will be informed using the email address that you register with bio-protocol.
You are highly recommended to post your data including images for the troubleshooting.

You are highly recommended to post your data (images or even videos) for the troubleshooting. For uploading videos, you may need a Google account because Bio-protocol uses YouTube to host videos.