高通量分析果蝇节律的实验方法   

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Original research article

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Rice Protocol e-book

 

摘要:从果蝇到人类,大多数生物的生理活动和行为都呈现出周期约为24 h的近日节律。近日节律与各种生命活动和多种疾病关系密切,研究果蝇的节律可以帮助我们揭示节律运行的分子机制及功能。本实验使用Trikinetics果蝇活动监测系统,将待测果蝇单独放置在玻璃管中,通过红外光束来探测并计算其活动。一段时间的活动监测和数据收集之后,利用专业的软件可以分析计算果蝇的活动节律。

关键词: 黑腹果蝇, 近日节律, 行为学, 高通量分析

材料与试剂

  1. 橡皮筋
  2. 锡箔纸
  3. 毛笔
  4. 带孔塑料塞
  5. 野生型果蝇w1118 (FlyBase ID: FBst0005905)
  6. 玉米粉 (食用级)
  7. 葡萄糖 (国药,沪试,catalog number: 10010518)
  8. 蔗糖 (国药,沪试,catalog number: 10021418)
  9. 高活性干酵母 (安琪酵母)
  10. 无水乙醇 (国药,沪试,catalog number: 10009218)
  11. 对羟基苯甲酸甲酯 (国药,沪试,catalog number: 30119426)
  12. 丙酸 (国药,沪试,catalog number: 81011918)
  13. 琼脂粉 (天津致远)

仪器设备

  1. 烧杯
  2. 果蝇饲养管 (2.5 x 9.5 cm透明聚苯乙烯塑料管)
  3. 光照培养箱 (宁波莱福科技有限公司)
  4. 果蝇活动监测系统 (Trikinetics, Waltham, MA, USA)
  5. 高压蒸汽灭菌器 (日本松下,model: MLS-3751L-PC)
  6. 体式显微镜 (重庆奥特光学仪器有限公司)
  7. CO2麻醉板

实验步骤

  1. 准备待测果蝇
    使用标准果蝇食物饲养果蝇 (温度:25 °C,湿度:50%,光照:12 h光照/12 h黑暗);监测果蝇年龄应在2-5天;由于雌蝇产卵可能会影响活动监测结果,因此监测活动节律一般使用雄蝇。
  2. 准备监测管
    1. 用橡皮筋将洁净干燥的玻璃管 (约160根) 扎好后垂直放入500 ml烧杯中,用锡箔纸包裹杯口,准备灭菌。
    2. 用双蒸水配置含5%蔗糖和2%琼脂的食物溶液,锡箔纸封住杯口后与监测管一同灭菌。
    3. 待灭菌结束后取出监测管和食物,用移液管将食物沿壁加入烧杯中 (每个烧杯加入50 ml),待其冷却凝固。
    4. 从烧杯中取出监测管,擦净监测管外壁残余食物,用塑料塞封住食物端。
  3. 装配果蝇
    1. 用二氧化碳麻醉果蝇。
      注:由于二氧化碳麻醉会对果蝇产生不利影响,麻醉时间应避免超过5 min。
    2. 用毛笔将果蝇移入监测管中 (一根监测管一只果蝇)。
    3. 将装入果蝇的监测管插入监测板中,并用带孔塑料塞封住非食物端。
      注:尽量将同一基因型同一性别的果蝇装在同一块监测板中,并准确记录果蝇基因型及其对应监测板号码和监测管位置。
    4. 待监测板上果蝇装配完成后,尽量使监测管中部 (无食物部分) 对准监测板上红外线发射/接收处,并用橡皮筋固定每根监测管 (图1)。


      图1. 果蝇活动监测板实物图。图中所示为橡皮筋固定监测管食物端,每两排监测管用一根皮筋固定。

  4. 将监测板放入预先设置好温度、湿度的培养箱中,并用电话线将其与数据收集系统相连。
  5. 在电脑上打开数据收集软件,设置收集数据间隔为1 min并确认连接好的监测板已开始收集数据。
    注:一旦开始监测,一直到监测结束,如无必要请勿打开培养箱以免影响果蝇活动导致监测结果受影响。
  6. 设置培养箱监测期间光照变化程序,一般是7天12 h光照/12 h黑暗 (LD),接下来7天持续黑暗 (DD)。设置完成后即可等待监测结束。
    注:7天DD活动数据可用于分析计算果蝇活动节律的周期、强度和节律果蝇占比等相关参数。

结果与分析

  1. 收集并处理数据
    1. 监测结束后将所收集的数据复制到新文件夹中,然后将其导入DAMFileScan软件 (版本:1.0.7.0,Trikinetics) 中。
    2. 在DAMFileScan软件中转换数据格式:在“Bin Length”处设置数据间隔为
      30 min;在“Output File Type”处设置输出数据文件格式为“Channel Files”;在左侧“First Bin to Save”处设置数据开始日期,时间设置为“00:30:00”;在右侧“Last Bin to Save”处设置数据结束日期,时间设置为最近的时间 (例如,下午三点收集数据,则时间设置为“15:00:00”);在“Extra Readings”处选择“Sum into Bin”;在“RunName”处为导出数据命名;最后点击“Save”保存即可。
      注:转换数据格式时尽量均以所要分析数据第一天为开始日期,便于后期不同批次实验数据结合。
  2. 分析节律
    节律分析使用ClockLab软件 (Actimetrics,版本:2.72),以30 min为间隔计算周期 (图2)。
    1. 通过MATLAB打开ClockLab,打开“MATLAB”输入“CL”后点击回车。
    2. 点击界面左上角“Open File”键,从转换格式后的文件中任选一个。
    3. 在右下方面板中的“Block Size”处选择数据间隔为30 min,“Start/End Hour”处均选为0。
    4. 设置节律性分析的参数
      点击界面右上方“Preferences”键,然后在弹出界面中“Periodogram”下方“Confidence”处设置置信水平为0.01,在“Range”处设置周期时长范围 (最低限为17 h,最高限为40 h),然后关闭该界面。
    5. 选择数据分析日期
      在主界面中“Start/End Dates”处设置开始日期为DD第1天的日期,结束日期为收集数据的日期。
    6. 节律性分析
      点击主界面左下角“Batch Analysis”键,在弹出界面中选中需要分析的数据;在右边面板中确认并勾选相关参数:“P’gram peak1” (卡方周期图分析,日期设为全部持续黑暗时间段),“Avg Counts” (平均活动量,日期设为持续黑暗最后一天) 等,点击“Go”开始分析。
    7. 节律分析结果说明
      分析结束后结果生成“BatchAnal”文件,使用Excel打开。其中主要参数有以下几项:
      1)
      “Tau”:通过卡方周期图计算出17-40 h之间节律性最强时对应的周期时长,即果蝇活动周期。
      2)
      “power”:该果蝇活动周期所对应的节律性大小。
      3)
      “Significance”:置信水平为0.01且周期在17-40h之间时该果蝇节律性背景值。
    8. 排除死果蝇
      分析每只果蝇DD最后一天的活动,将活动量为0的果蝇删除。
    9. 整理分析结果
      通过“power”与“significance”相减可计算得到“p-s” (表示果蝇节律强弱),若“p-s”小于10则认为该果蝇没有节律,计算平均周期时将该果蝇排除 (计算节律强度平均值时需保留)。最终得到每种基因型果蝇以下参数:
      1)
      果蝇数目“N”;
      2)
      有节律的果蝇占存活果蝇百分比“rhythmic”;
      3)
      果蝇节律性强弱“p-s”;
      4)
      果蝇平均周期长度“Tau”。


    图2. ClockLab软件示意图及单只果蝇节律分析结果图。 A. ClockLab软件操作主界面。B. 单只w1118雄蝇卡方分析周期图,横坐标表示周期时长,纵坐标表示某一周期时长对应的振幅大小。C. 单只w1118雄蝇14天活动图,横坐标表示时间 (蓝色区域为白天光照阶段,空白条纹为夜晚黑暗阶段),纵坐标表示日期 (2号至9号为LD,9号至16号为DD),黑色小块表示果蝇活动。

溶液配方

  1. 标准果蝇食物配方
    琼脂粉 5 g
    蔗糖 31.62 g
    葡萄糖 63.2 g
    玉米粉 77.7 g
    酵母 30 g
    丙酸 4.3 ml
    10%对羟基苯甲酸甲酯 (溶于无水乙醇) 10 ml
    双蒸水 1 L
  2. 活动监测期间果蝇食物配方
    琼脂粉 20 g
    蔗糖 50 g
    双蒸水 1 L

致谢

本课题得到国家自然科学基金面上项目 (31471125和31671215) 的支持。

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:郑刘彬 , 张珞颖 . (2019). 高通量分析果蝇节律的实验方法. Bio-101: e1010244. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010244.
How to cite: Zheng, L. B. and Zhang, L. Y. (2019). A High-Throughput Method for Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms in Drosophila. Bio-101: e1010244. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010244.
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