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苹果果肉细胞胶体金免疫电镜观察样品的制备   

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摘要:通过超薄切片,获得细胞水平的结构;同时通过免疫染色,观察目的蛋白在细胞内的定位及变化情况。

关键词: 胶体金, 免疫定位, 细胞

材料与试剂

注: 以下试剂除特别说明外,均购自Sigma-Aldrich公司。

  1. 苹果
  2. 多聚甲醛
  3. 戊二醛
  4. PBS (磷酸缓冲液,pH 7.2)
  5. 乙醇
  6. Lowicryl K4M
  7. Formvar膜
  8. 金标羊抗兔抗体 (Amersham Pharmacia Biotech)
  9. 柠檬酸铅
  10. 兔血清
  11. Na2HPO4
  12. KH2PO4
  13. KCl
  14. NaCl
  15. 明胶
  16. BSA
  17. Tween 20
  18. 2% (w/v)醋酸双氧铀 (蒸馏水配制)
  19. 前固定液 (见溶液配方)
  20. 含50 mM甘氨酸缓冲液 (见溶液配方)
  21. PBGT缓冲液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 镍网
  2. 抽气泵
  3. 紫外灯
  4. LKB-8800型切片机
  5. 透射电镜

实验步骤

  1. 样品包埋
    1.1 固定:将苹果果肉切分成2-3 mm3的小块,迅速投入已预冷的前固定液 (见溶液配方1)中,抽气直到组织块完全浸入固定液,4 °C下固定4 h。
    1.2 冲洗:用0.1 M PBS (磷酸缓冲液,pH 7.2;280 ml 1 mol/L磷酸二氢钠,720 ml 1 mol/L磷酸氢二钠) 4 °C洗三次,每次30 min。
    1.3 乙醇系列脱水
          30%乙醇 (20min)→50%乙醇 (20min)→70%乙醇 (过夜)→80%乙醇 (20min)→90%乙醇 (60min)→100%乙醇 (60min)→100%乙醇 (60min)
    1.4 乙醇-Lowicryl K4M置换
          无水乙醇:K4M 2:1 1 h
          无水乙醇:K4M 1:1 1 h
          无水乙醇:K4M 1:2 1 h
          纯K4M 1 h (此为逐步过渡到K4M中,1 h后更换K4M,然后浸透过夜)
    1.5 浸透:换入新的纯K4M浸透过夜 (以上步骤均在4 °C下进行)。
    1.6 包埋:紫外灯下 (-20 °C) 聚合48 h以上,室温继续聚合3天以上,直到手感可触硬化。
    1.7 切片:用LKB-8800型切片机制备超薄切片,切片捞在100目以0.3% Formvar膜覆盖的镍网上。
  2. 免疫染色
    2.1. 切好的超薄切片先用含50 mM甘氨酸缓冲液 (见溶液配方2) 室温下处理30 min以封闭自由醛基,然后在PBGT溶液 (见溶液配方3) 中继续封闭30 min以封闭非特异性位点。
    2.2. 切片不经清洗,直接在用PBGT缓冲液稀释100倍的一抗中于4 °C下温育过夜 (或室温下1-2 h)。
    2.3. 经PBGT充分洗涤3次,每次5 min。
    2.4. 清洗完毕后,转入用PBGT稀释的金标羊抗兔抗体 (交联10 nm金颗粒,1:50比例稀释),室温下温育1-2 h。
    2.5. 经PBGT冲洗三遍,后经双蒸水充分洗涤三遍。每次5 min。
    2.6. 2% (w/v)醋酸双氧铀室温染色18 min,之后用双蒸水冲洗3次。
    2.7. 柠檬酸铅继续染色10 min,用双蒸水充分洗涤 (6 x 5 min)。
    2.8. 用透射电镜进行细胞超微结构及金颗粒定位观察。
    注:为了检验免疫定位结果的特异性和可靠性,需分别设置2种不同的对照:
    1. 以免疫前兔血清代替蛋白抗体以验证一抗的特异性;
    2. 免去蛋白抗体以检测二抗的非特异性标记,其余步骤同上。

溶液配方

注:本实验方案中所需的溶液除特殊说明外,均用蒸馏水配制。

  1. 前固定液
    4% (w/v) 多聚甲醛
    2.5% (v/v) 戊二醛
    0.1 M PBS, pH 7.2 配制
  2. 50 mM甘氨酸缓冲液, pH 7.4
    Na2HPO4
    8 mM
    KH2PO4
    1.5 mM
    KCl
    3 mM
    NaCl
    500 mM
  3. PBGT缓冲液
    PBS缓冲液
    0.1% (w/v) 明胶
    0.5% (w/v) BSA
    0.1% (v/v) Tween 20

致谢

本篇实验方案改编自先前发表的文章 Zhang et al. (2004)。

参考文献

  1. Zhang, L. Y., Peng, Y. B., Pelleschi-Travier, S., Fan, Y., Lu, Y. F., Lu, Y. M., Gao, X. P., Shen, Y. Y., Delrot, S. and Zhang, D. P. (2004). Evidence for apoplasmic phloem unloading in developing apple fruit. Plant Physiol 135(1): 574-586.
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:张凌云. (2018). 苹果果肉细胞胶体金免疫电镜观察样品的制备. Bio-101: e1010242. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010242.
How to cite: Zhang, L. Y. (2018). (2018). Sample Preparation of Apple Fruit for Observation of Protein Subcellular Localization by Immunogold Labeling and Electron Microscopy. Bio-101: e1010242. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010242.
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