Sample Preparation of Apple Fruit for Observation of Protein Subcellular Localization by Immunogold Labeling and Electron Microscopy   

材料与试剂

注: 以下试剂除特别说明外，均购自Sigma-Aldrich公司。

1. 苹果
2. 多聚甲醛
3. 戊二醛
4. PBS (磷酸缓冲液，pH 7.2)
5. 乙醇
6. Lowicryl K4M
7. Formvar膜
8. 金标羊抗兔抗体 (Amersham Pharmacia Biotech)
9. 柠檬酸铅
10. 兔血清
11. Na₂HPO₄
12. KH₂PO₄
13. KCl
14. NaCl
15. 明胶
16. BSA
17. Tween 20
18. 2% (w/v)醋酸双氧铀 (蒸馏水配制)
19. 前固定液 (见溶液配方)
20. 含50 mM甘氨酸缓冲液 (见溶液配方)
21. PBGT缓冲液 (见溶液配方)

仪器设备

1. 镍网
2. 抽气泵
3. 紫外灯
4. LKB-8800型切片机
5. 透射电镜
   

实验步骤

1. 样品包埋
   1.1 固定：将苹果果肉切分成2-3 mm³的小块，迅速投入已预冷的前固定液 (见溶液配方1)中，抽气直到组织块完全浸入固定液，4 °C下固定4 h。
   1.2 冲洗：用0.1 M PBS (磷酸缓冲液，pH 7.2；280 ml 1 mol/L磷酸二氢钠，720 ml 1 mol/L磷酸氢二钠) 4 °C洗三次，每次30 min。
   1.3 乙醇系列脱水
         30%乙醇 (20min)→50%乙醇 (20min)→70%乙醇 (过夜)→80%乙醇 (20min)→90%乙醇 (60min)→100%乙醇 (60min)→100%乙醇 (60min)
   1.4 乙醇-Lowicryl K4M置换
         无水乙醇:K4M 2:1 1 h
         无水乙醇:K4M 1:1 1 h
         无水乙醇:K4M 1:2 1 h
         纯K4M 1 h (此为逐步过渡到K4M中，1 h后更换K4M，然后浸透过夜)
   1.5 浸透：换入新的纯K4M浸透过夜 (以上步骤均在4 °C下进行)。
   1.6 包埋：紫外灯下 (-20 °C) 聚合48 h以上，室温继续聚合3天以上，直到手感可触硬化。
   1.7 切片：用LKB-8800型切片机制备超薄切片，切片捞在100目以0.3% Formvar膜覆盖的镍网上。
2. 免疫染色
   2.1. 切好的超薄切片先用含50 mM甘氨酸缓冲液 (见溶液配方2) 室温下处理30 min以封闭自由醛基，然后在PBGT溶液 (见溶液配方3) 中继续封闭30 min以封闭非特异性位点。
   2.2. 切片不经清洗，直接在用PBGT缓冲液稀释100倍的一抗中于4 °C下温育过夜 (或室温下1-2 h)。
   2.3. 经PBGT充分洗涤3次，每次5 min。
   2.4. 清洗完毕后，转入用PBGT稀释的金标羊抗兔抗体 (交联10 nm金颗粒，1:50比例稀释)，室温下温育1-2 h。
   2.5. 经PBGT冲洗三遍，后经双蒸水充分洗涤三遍。每次5 min。
   2.6. 2% (w/v)醋酸双氧铀室温染色18 min，之后用双蒸水冲洗3次。
   2.7. 柠檬酸铅继续染色10 min，用双蒸水充分洗涤 (6 x 5 min)。
   2.8. 用透射电镜进行细胞超微结构及金颗粒定位观察。
   注：为了检验免疫定位结果的特异性和可靠性，需分别设置2种不同的对照：
   
   1. 以免疫前兔血清代替蛋白抗体以验证一抗的特异性；
   2. 免去蛋白抗体以检测二抗的非特异性标记，其余步骤同上。

溶液配方

注：本实验方案中所需的溶液除特殊说明外，均用蒸馏水配制。

1. 前固定液
   4% (w/v) 多聚甲醛
   2.5% (v/v) 戊二醛
   0.1 M PBS, pH 7.2 配制
2. 50 mM甘氨酸缓冲液, pH 7.4
   

   Na2HPO4	8 mM
   KH2PO4	1.5 mM
   KCl	3 mM
   NaCl	500 mM

3. PBGT缓冲液
   PBS缓冲液
   0.1% (w/v) 明胶
   0.5% (w/v) BSA
   0.1% (v/v) Tween 20

致谢

本篇实验方案改编自先前发表的文章 Zhang et al. (2004)。

参考文献

1. Zhang, L. Y., Peng, Y. B., Pelleschi-Travier, S., Fan, Y., Lu, Y. F., Lu, Y. M., Gao, X. P., Shen, Y. Y., Delrot, S. and Zhang, D. P. (2004). Evidence for apoplasmic phloem unloading in developing apple fruit. Plant Physiol 135(1): 574-586.