Semi-quantification of Strawberry Gene Expression by RT-PCR   

材料与试剂

1. 离心管
2. Oligo dT₁₈
3. DEPC-H₂O
4. 2x PCR Taq Master
5. 冰
6. RRI
7. MLV
8. TAE缓冲液
9. 琼脂糖
   

仪器设备

1. 移液枪
2. 离心机
3. -20 °C冰箱
4. PCR仪
5. 电泳仪
   

实验步骤

1. 反转录体系cDNA第一链合成 (25 μl)
   根据测定的浓度计算1 μg总RNA所需的体积
   
   1)

   2 μl oligodT₁₈ (反转录引物) + 1 μg总RNA + DEPC-H₂O = 15 μl，轻匀混合，稍离心；
   2)

   70 °C 10 min；
   3)

   立即冰浴5 min；
   4)

   加混合液10 μl (每管10 μl，根据反应的数量调整相应混合液的量，可适当多配制一些以补偿转移过程中的损失)；
   混合液配制 (10 μl)：
   

   M-MLV buffer	5 μl
   dNTP	1 μl (浓度10 mM)
   RRI	0.7 μl
   MLV	1 μl
   DEPC-H2O	2.3 μl

    注：配置混合液是用枪吸打均匀，吸打15次。
   5)

   42 °C 1 h，70 °C 10 min (恒温PCR)；
   6)

   反转录得到mRNA-cDNA的杂交链，-20 °C保存。
   
   
2. 半定量RT反应 (10 μl体系)，在PCR管中混合以下溶液：
   
   轻匀混合，稍离心
   
   1)

   在PCR仪上按下述程序反应：
   起始变性：95 °C 3min
   按下述条件进行28个循环
   变性：95 °C 30 sec
   退火：55 °C 30 sec (根据实际温度设定退火温度)
   延伸：72 °C 30 sec (1,000 bp/min) 根据实际长度设定时间
   最终延伸：72 °C 5 min
   2)

   配置1%琼脂糖胶 (见溶液配方) (100 ml TAE缓冲液 + 1 g琼脂糖)，然后跑琼脂糖电泳，检测PCR产物。

注意事项

1. 保证基因间PCR产物长度相近，确保在同一延伸时间内扩增目的片段。
2. 引物长度在20 bp-25 bp范围内，保证产物的特异性。
3. 引物退火温度在55 °C左右，上下游引物退火温度保持相近。
4. 引物自身及上下游引物间应不存在二聚体。