拟南芥蘸花侵染   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:用农杆菌浸染拟南芥花序,利用授粉受精的过程,将农杆菌导入胚珠,从而结出含有目的基因的转基因种子。农杆菌浸染花序遗传转化方法避免了愈伤组织培养过程,而且可节省大量的时间。
实验目的:通过农杆菌蘸花侵染拟南芥< /b>获得转基因拟南芥植株用于基因功能研究。

关键词: 拟南芥, 农杆菌, 蘸花, 转基因

材料与试剂

  1. 培养钵
  2. 保鲜膜
  3. 营养土 (泥炭土:蛭石:牛粪=1:1:1)
  4. 带有目的基因载体的农杆菌菌株
  5. 苗龄5周左右的拟南芥植株
  6. 蔗糖
  7. Silwet-77 (国药集团)
  8. 含抗生素的LB培养基
  9. VB

仪器设备

  1. 剪刀
  2. 生长室
  3. 震荡培养箱
  4. 台式离心机
  5. 分光光度计

实验步骤

  1. 长日照 (光照16 h、黑暗8 h) 环境下种植健壮的拟南芥植株 (约5周)。
  2. 剪掉最开始抽出的1-5 cm长的初生主花序 (促进长出更多的侧生花序)。修剪后一个星期内进行渗透转化 (一般3~5 d)。并且在渗透转化的前1 d植株需充分浇水,以便植物气孔在转化时充分张开。
  3. 准备农杆菌液。通常先用1 ml 含抗生素的LB培养基培养已经转化了目的表达载体的农杆菌液,然后再吸取150 μl培养过夜的菌液加入到150 ml 新鲜的液体LB培养基中28 °C环境下震荡培养24 h。
  4. 4,000 x g,20 min离心菌液,然后将菌重悬于120 ml渗透液 (10%蔗糖 + 400 μl/L Silwet-77,蘸花前充分混匀,OD600=0.8-1.0) 中。与此同时,剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花。
  5. 将植株的地上部分浸入菌液中1 min,轻微震荡。
  6. 用保鲜膜将侵染过的植株罩起来以保持湿度,暗培养1 d,然后置于正常培养条件,2~3 d后可去掉保鲜膜,转化后1周左右方可浇水,并定期继续侵染几次。
  7. 继续培养至植物成熟,收种子放在干燥环境中1周左右,即可筛选转化子。

注意事项

  1. 在去除初生花序后,次生花序约2-10 cm时最适宜侵染。因为此时有许多可用来侵染的花蕾。
  2. 渗透液浓度在0.15~1.74之间时,转化率没有明显变化。
  3. Silwet L-77浓度在0.02%~0.1%时,转化率是0.005%时的10-20倍,故一般采用的浓度为0.05%。但是,值得注意的是利用高浓度的Silwet L-77进行侵染时,在某些环境下会导致植物组织坏死。
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:徐远涛 , 徐强 . (2018). 拟南芥蘸花侵染. Bio-101: e1010203. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010203.
How to cite: Xu, Y. T. and Xu, Q. (2018). Transformation of Arabidopsis thaliana by Floral Dip. Bio-101: e1010203. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010203.
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