PCR Amplification and Gene Cloning   

材料与试剂

1. 各种型号枪头
   
2. 离心管
   
3. PCR用八连管
   
4. 矿物油
   
5. 封口膜
   
6. 玻璃涂布棒
   
7. DNA模板 (或cDNA)
   
8. DNA聚合酶 (Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase, 诺唯赞, catalog number: P505-d1)
   
9. dNTP
   
10. 引物
    
11. 双蒸水
    
12. Gene Ruler (Thermo Scientific Gene Ruler 1 kb DNA ladder, catalog number: SM0311)
    
13. 琼脂糖
    
14. 核酸染料 (GelRed)
    
15. 冰醋酸
    
16. NaCl
    
17. 胰蛋白胨
    
18. 酵母提取物
    
19. 琼脂粉
    
20. 琼脂糖胶纯化试剂盒 (Gel Extraction Kit, OMEGA, catalog number: D2500-02)
    
21. 克隆质粒 (Zero-Background P-Topo-Blunt Simple Cloning Kit, Aidlab, catalog number: CV17)
    
22. Trans 5α E. coli感受态细胞 (全式金生物科技有限公司)
    
23. 质粒提取试剂盒 (AxyPrep Plasmid Kit, AXYGEN, catalog number: 21515KA1)
    
24. TAE缓冲液 (见溶液配方)
    
25. 氨苄霉素 (见溶液配方)
    
26. LB培养基 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 涡旋仪
   
2. 小离心机
   
3. PCR仪
   
4. 电泳仪
   
5. 凝胶成像系统
   
6. 切胶仪
   
7. 离心机 (配备1.5 ml转头)
   
8. 恒温水浴锅
   
9. 恒温摇床
   
10. 恒温培养箱
    
11. 酒精灯
    
12. 制胶槽
    
13. 梳子
    
14. 手术刀
    
15. 超净工作台
    
16. 细胞培养平板
    

实验步骤

1. PCR引物设计
   1.1

   引物长度约为16-30 bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高；太长则比较浪费，且难以合成。
   
   1.2

   引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 T_m=4(G+C)+2(A+T)。
   
   1.3

   引物T_m值控制在55-65 °C之间。
   
   1.4

   四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。
   
   1.5

   在引物内，尤其在3'端应不存在二级结构。
   
   1.6

   两引物之间尤其在3'端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
   
   1.7

   引物5'端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
   
   1.8

   正反向引物的T_m值以及GC含量应尽量一致；引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与T_m值计算。
   
   1.9

   推荐引物设计软件：Primer 5.0。
2. PCR反应
   2.1

   严格按照DNA聚合酶产品说明书在PCR仪上设置PCR反应程序，一般程序为：

   Step 1: 95 °C	3 min	预变性
   Step 2: 95 °C	30 s	变性
   Step 3: 55 °C	30 s	退火
   Step 4: 72 °C	30-60 s/kb	延伸，时间依据PCR产物长度而定
   Step 5: goto Step 2-4，	34个循环	循环扩增
   Step 6: 72 °C	10 min	充分延伸
   Step 7: 12 °C	30 min	反应种植，低温保存

   2.2

   PCR反应体系：严格按照DNA聚合酶产品说明书配比。一般体系(50 μl)为：

   2x PCR Buffer	25 μl
   dNTP (10 mM)	1 μl
   Primer F (10 mM)	2.5 μl
   Primer R (10 mM)	2.5 μl
   模板DNA (100 ng/μl)	2 μl
   Phanta DNA聚合酶(2.5 U)	1 μl
   双蒸水	16 μl

   2.3

   PCR体系配好后轻微涡旋混匀，分装到八连管中，稍离心，每管滴入一滴矿物油。
   
   2.4

   将配好体系的八连管放入PCR仪中，运行程序。
3. 琼脂糖凝胶电泳检测
   3.1

   用1x TAE配制1.5%浓度琼脂糖胶 (60 ml TAE加0.9 g琼脂糖)，微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解，自来水冷却至约60-70 °C (体感可承受)，滴入一滴核酸染料，摇匀后倒入放有制胶托板的制胶槽 (中号，13x50 μl孔)中，插入梳子 (50 μl)，冷却凝固15 min。
   
   3.2

   将PCR反应液全部加入到制好的琼脂糖胶孔中，加入适当大小的Marker (一般为1 kb Gene Ruler)，100 V电泳30 min。
   
   3.3

   取出琼脂糖胶放入凝胶成像系统中拍照，检查扩增产物目标条带。
4. 目的条带回收纯化：参照Marker条带分子量大小，判断目的片段条带，用手术刀在紫外发光仪上切取目的条带胶块，参照胶回收试剂盒说明书回收纯化目的基因片段，并用NanoDrop1000检测胶回收产物浓度。
   
5. 目的片段与克隆载体连接: 依据克隆载体说明书建立连接体系。
   以P-Topo-Blunt 载体为例：

   P-Topo Vector	1 μl
   Enhancer Buffer	1 μl
   目的片段回收产物	20 ng/kb (依据产物长度而定)
   双蒸水	补齐至5 μl

   将以上试剂按顺序加入到200 μl带盖PCR管中，然后在PCR仪上25 °C孵育连接，孵育时间根据目的基因片段长度而定，15 min/kb。
   
6. 转化感受态细胞：
   6.1

   开启超净工作台风机，紫外灯灭菌15 min。
   
   6.2

   超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞(每管100 μl)放冰上融化，在超净工作台上用无菌的1.5 ml离心管将大肠杆菌感受态细胞分装为两管，每管50 μl。
   
   6.3

   在超净工作台上将连接产物全部加入到大肠杆菌感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰上孵育30 min。此间打开恒温水浴锅，设置温度为42 °C。
   
   6.4

   将孵育后的感受态细胞放入42 °C水浴锅中热激90 s，迅速取出放冰上静置2 min。
   
   6.5

   热激后的感受态细胞中加入400 μl液体LB培养基，37 °C恒温摇床上220 rpm转速培养活化1 h。
   
   6.6

   取一瓶150 ml固体LB培养基在微波炉中加热融化后自来水降温至60-70 °C，加入150 μl氨苄霉素，摇匀后倒皿，制成细胞培养平板，冷却晾干。
   
   6.7

   酒精灯外焰烧玻璃涂布棒，冷却待用。
   
   6.8

   从活化1 h后的400 μl菌液中吸取200 μl到制好的细胞培养平板上，用烧过的玻璃涂布棒均匀涂皿至不能看到菌液，稍吹干。
   
   6.9

   将涂好的细胞培养皿用封口膜封口，倒置放入37 °C恒温培养箱培养12-16 h。
   
7. 挑取单克隆
   7.1

   取一瓶50 ml液体LB培养基，超净工作台上加入50 μl氨苄霉素摇匀，分装到无菌的1.5 ml中，每管500 μl。
   
   7.2

   用10 μl枪头在细胞培养平板上挑取单克隆斑点，在装有液体LB培养基的离心管中吸打2-3下，将菌斑接种到液体LB培养基中。每个平板挑取8个单克隆斑点。
   
   7.3

   接种后的液体LB培养基在37 °C恒温摇床上220 rpm转速培养5-8 h。
   
   7.4

   菌液PCR检测阳性：吸取0.5 μl菌液作为模板进行PCR反应扩增目的基因。
   
   7.5

   根据菌液PCR检测结果，挑取3-4个阳性克隆菌液送公司测序。一般吸200 μl菌液送测序公司检测，剩余菌液暂时放4 °C冰箱保存。
8. 单克隆质粒提取：根据测序结果，选取序列正确无误的阳性克隆菌液接种到20-30 ml含氨苄霉素的液体LB培养基中，37 °C恒温摇床上220 rpm转速培养12 h，用质粒提取试剂盒提取质粒。

注意事项

1. PCR试剂应放在冰上融化，用完后及时放回-20 °C冰箱。
   
2. PCR是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的，因此，在进行PCR前，模板的纯化和引物设计尤为重要。
   
3. 进行PCR实验时为了保证实验的可靠性，需要设置阴性对照 (不加DNA,以双蒸水为模板) 和阳性对照 (确定一定可以扩出目的条带的模板)。
   
4. 切胶回收时尽量只切取目的条带，切下胶块尽量薄，减少杂质污染。
   
5. 大肠杆菌转化过程均应在超净工作台操作，所用的离心管、枪头、培养基均需要121 °C、15 min灭菌。
   
6. 本实验所用的克隆载体Topo-Blunt为平末端克隆载体，高保真酶PCR产物一般均为平末端产物，所以可以直接连接转化。若用Pmd18-T载体 (粘性末端) 做TA克隆，用高保真酶PCR产物需要加1 μl Taq酶72 °C孵育5 min，在PCR产物3’端加一个A碱基使之成为粘性末端 (Taq酶PCR产物3’端会多出一个A碱基)。
   

溶液配方

1. TAE缓冲液
   先配制50x TAE，称取242 g Tris、37.2 g Na₂EDTA·2H₂O倒入1 L蓝盖瓶中，然后加入800 ml的双蒸水，充分搅拌溶解，加入57.1 ml的冰醋酸，充分混匀。加双蒸水定容至1 L，室温保存。需要使用的时候，稀释为1x TAE作为工作液。一般使用10 L的带嘴塑料壶，倒入200 ml 50x TAE，再用双蒸水定容至10 L，混匀备用。
   
2. 氨苄霉素
   5 g氨苄霉素粉末溶解于100 ml双蒸水中，配成浓度为50 mg/ml的氨苄霉素溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤灭菌后分装为1 ml每管，-20 °C冻存。使用时以1:1,000的比例加入到LB培养基中，终浓度为50 μg/ml。
   
3. LB培养基
   1 L固体LB培养基成分为10 g NaCl、10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、15 g琼脂粉，加水定容至1 L，121 °C、15 min灭菌。液体LB不加琼脂粉。