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Construction of Binary Expression Vector Using Gateway System   

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实验原理:Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统 (attB x attP →attL x attR)。BP和LR两个反应就构成了Gateway™技术。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应,创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。Gateway利用了位点特异重组,所以在构建入门载体后,不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦拥有一个入门克隆,就可以多次使用它,转移目的基因到Gateway改造过的各种表达载体。
实验目的:利用Gateway技术构建双元表达载体,主要包括超量表达载体、干涉载体以及启动子活性分析载体等,用来进行转基因功能验证。本实验以构建甜橙基因Cs7g29500的超量表达载体为例。

关键词: Gateway, 载体构建, BP反应, LR反应

材料与试剂

  1. 目的基因质粒
  2. 目的基因正反向引物
  3. BP酶
  4. LR酶
  5. 入门载体 (pDONR207,庆大霉素抗性)
  6. Gateway超量表达终载体 (pK7WG2D,壮观霉素抗性)
  7. Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (诺唯赞,catalog number: P505-d1)
  8. 大肠杆菌Db3.0感受态细胞
  9. 其它材料试剂参见“PCR扩增及克隆基因” (徐远涛和徐强, 2018)
  10. 60%甘油 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 低温水浴锅
  2. 其他设备参见“PCR扩增及克隆基因” (徐远涛和徐强, 2018)

实验步骤

  1. 目的基因Cs7g29500的克隆
    1.1
    根据基因Cs7g29500的CDS序列设计如下引物:
    attB1_Cs7g29500-ox-F: AAAAAGCAGGCTCCATGGCAATTTCAGCATTCAGAG
    attB2_Cs7g29500-ox-R: AGAAAGCTGGGTTTCATTTGAAACTGTCTCT
    Adapter attB1: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
    Adapter attB2: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT
    绿色背景序列为Cs7g29500的CDS序列正反向引物,同时加了接头序列 (下划线部分序列)。克隆其它任何基因时,一般截取CDS起始密码子开始的20个碱基替换attB1_Cs7g29500-ox-F引物中的绿色背景序列,截取CDS终止密码子往前20个碱基的反向互补序列替换attB2_Cs7g29500-ox-R引物中的绿色背景序列,下划线部分序列不变。
    1.2
    第一轮PCR反应:
    20 μl体系:

    双蒸水
    7.7 μl
    2x Phanta Max Buffer
    10 μl
    dNTPs (2mM each)
    0.4 μl
    attB_ Cs7g29500-ox_F
    0.5 μl
    attB_ Cs7g29500-ox_R
    0.5 μl
    目的基因质粒
    0.5 μl
    Phanta Max酶
    0.4 μl


    PCR程序:

    Step 1: 95 °C
    3 min
    Step 2: 95 °C
    15 s
    Step 3: 55 °C
    15 s
    Step 4: 72 °C
    30-60 s/kb
    Step 5: goto Step 2-4,
    34个循环
    Step 6: 72 °C
    5 min
    Step 7: 12 °C
    30 min
    1.3
    一轮PCR反应完成后,取部分PCR产物跑胶检测用否清晰目的带。如有,则取1 μl剩余PCR产物作为模板,进行第二轮反应。
    1.4
    第二轮PCR反应:
    50 μl体系:

    双蒸水
    17 μl
    2x Phanta Max Buffer
    25 μl
    dNTPs (2mM each)
    1 μl
    attB_ Cs7g29500-ox_F
    2.5 μl
    attB_ Cs7g29500-ox_R
    2.5 μl
    一轮PCR产物 1 μl
    Phanta Max酶
    1 μl


    PCR程序:

    Step 1: 95 °C
    3 min
    Step 2: 95 °C
    15 s
    Step 3: 55 °C
    15 s
    Step 4: 72 °C
    30-60 s/kb
    Step 5: goto Step 2-4,
    34个循环
    Step 6: 72 °C
    5 min
    Step 7: 12 °C
    30 min
    1.5
    50 μl反应产物全部在大孔胶上样,跑胶,切目的带回收,用Nanodrop测回收产物浓度,标记名为attB-Cs7g29500-ox以准备下步实验。
  2. BP反应
    2.1
    BP反应及体系:

    其中,X=(质粒的大小*16.5)/质粒浓度;质粒大小用kb表示,比如Cs7g29500大小为1.6 kb,而浓度为10 ng/μl,则X=16.5*1.6/10;Y=(质粒的大小*16.5)/质粒浓度 (计算同X,但是pDONR207大小为约5.5 kb),一般质粒载体浓度调整为150 ng/μl使用。
    2.2
    反应液在25 °C水浴至少4 h或过夜,不需要终止反应而直接用于大肠杆菌转化,方法参照“PCR扩增及克隆基因” (徐远涛和徐强, 2018)。转化后37 °C培养过夜长出单克隆。PCR鉴定阳性后,挑单克隆菌液送测序,确认序列正确无误后扩繁提质粒用于做LR反应 (质粒名称定为pDONR207_Cs7g29500-ox)。
  3. LR反应
    3.1
    LR反应及体系:

    其中,X=(质粒的大小*16.5)/质粒浓度;质粒大小用kb表示,比如pDONR207-Cs7g29500-ox大小约为6kb,而若质粒浓度为100 ng/μl,则X=16.5*6/100;Y=(质粒的大小*16.5)/质粒浓度 (计算同X,但是pK7WG2D大小约为13 kb)。
    3.2
    反应液在25 °C水浴至少4 h或过夜,不需要终止反应而直接用于大肠杆菌转化,方法参照“PCR扩增及克隆基因”。转化后37 °C培养过夜长出单克隆。PCR鉴定阳性后,挑单克隆菌液送测序,确认序列正确无误后扩繁提质粒 (质粒名称定为pK7WG2D_Cs7g29500-ox)。

注意事项

  1. 常用入门载体主要有:pDONR207 (庆大霉素抗性)、pDONR201 (卡那霉素抗性)、pDONR221 (卡那霉素抗性)。载体上含有ccdB致死基因,不能通过常用Trans 5α E. coli感受态细胞来扩繁,需要用抗ccdB致死基因的感受态Db3.0来扩繁。
  2. Gateway载体非常丰富,可以满足各种转基因需求,可以在专业网站:https://gateway.psb.ugent.be/search查询载体详细信息。
  3. Gateway系统中载体一般都为壮观霉素和抗性,做克隆时确保使用含相应抗生素的平板。
  4. 在BP反应后,检测单克隆阳性所用引物为目的基因引物或者attB1和attB2或者组合引物;测序所需引物为:PDONR-F: TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC;PDONR-R: GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC。此为公共引物,测序公司可以会免费提供。pDONR221载体也可用M13引物检测阳性和测序。
  5. 在LR反应后,检测单克隆阳性所用引物为目的基因引物或者attB1和attB2或者组合引物;测序所需引物为:最好选择载体上的正向引物和基因本身的反向引物,比如:正向引物用35S,反向引物用attB2_Cs7g29500-ox-R。也可以用attB1、attB2测序。
  6. 获得序列正确的入门载体和终载体克隆之后,质粒保存于-20 °C冰箱,同时将菌液与60%甘油等体积2:1混合,甘油终浓度为20%,-80 °C超低温冰箱保存。

溶液配方

  1. 60%甘油
    300 ml甘油与200 ml双蒸水在500 ml蓝盖瓶中混合,121 °C、15 min灭菌,常温无菌保存备用。

参考文献

  1. 徐远涛,徐强. (2018). PCR扩增及克隆基因. Bio-101 e1010202. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010202.
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Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:徐远涛, 郑雄杰, 曾云流, 徐强. (2018). Gateway系统构建双元表达载体. Bio-101: e1010201. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010201.
How to cite: Xu, Y. T., Zheng, X. J., Zeng, Y. L. and Xu, Q. (2018). Construction of Binary Expression Vector Using Gateway System. Bio-101: e1010201. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010201.
Q&A

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jian meng
华中农业大学园艺林学学院
老师您好,这里第二轮PCR反应的引物是不是写错了,应该是Adapter attB1/Adapter attB2。
9/20/2022 9:55:08 AM Reply
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