高纯度柑橘基因组DNA提取与检测   

How to cite Favorites Q&A Share your feedback Cited by

Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:利用CTAB (十六烷基三甲基溴化铵) 作为一种阳离子去污剂,在高离子强度的溶液中与蛋白质和多聚糖形成复合物,而在低离子强度溶液中可以沉淀核酸与酸性多聚糖的特性将DNA从柑橘组织样品中分离出来< /b>。再通过有机溶剂抽提去除蛋白、多糖、酚类等杂质后用无水乙醇沉淀即可分离得到高纯度的基因组DNA。
实验目的:提取高质量基因组DNA用于后续基因组文库构建、酶切、PCR、Southern杂交等实验。

关键词: 柑橘, DNA, 提取, 检测

材料与试剂

  1. 50 ml BECKMAN离心管
  2. 10 ml离心管
  3. 各种型号的枪头 (5 ml,1 ml,200 μl,20 μl)
  4. 组织样品 (叶片愈,愈伤组织,果肉)
  5. 液氮
  6. CTAB (DNA提取缓冲液)
  7. β-巯基乙醇
  8. 氯仿 (三氯甲烷)
  9. 异戍醇
  10. 异丙醇
  11. Tris
  12. EDTA-Na2
  13. NaCl
  14. RNase A (Thermo Fisher Scientific, catalog number: EN0531,10 mg/ml)
  15. Tris-饱和酚
  16. NH4Ac
  17. 1 M Tris-HCl (pH 8.0) (见溶液配方)
  18. 0.5 M EDTA (pH 8.0) (见溶液配方)
  19. 5.0 M NaCl (见溶液配方)
  20. 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) (见溶液配方)
  21. CTAB buffer (见溶液配方)
  22. 氯仿:异戍醇 (24:1) (见溶液配方)
  23. 76%无水乙醇 (见溶液配方)
  24. TE缓冲液 (见溶液配方)
  25. 水饱和乙醚 (见溶液配方)
  26. 70%乙醇 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 研钵
  2. 离心管架 (50 ml,10 ml)
  3. 恒温水浴锅 (常州润华电器有限公司)
  4. 各种规格的移液器
  5. 离心机 (配备50 ml、10 ml转头,转速大于4,000 x g)
  6. -20 °C冰箱
  7. Nanodrop 1000微量紫外分光光度计
  8. 电泳仪 (北京六一仪器厂)
  9. 凝胶成像系统
  10. 磁力搅拌器

实验步骤

  1. 取2-5 g组织样品 (一般叶片取2 g,愈伤组织取3 g,果肉取4 g),加入适量液氮充分研碎,转入预冷的50 ml离心管,加入20 ml DNA提取缓冲液充分摇匀,于65 °C水浴60-90 min,水浴过程中每隔15 min轻轻摇匀一次。
  2. 加入15 ml氯仿:异戍醇 (24:1) 轻轻摇匀10 min,4,000 x g离心15 min。
  3. 取上清液转移到另一50 ml离心管加入10 ml氯仿:异戍醇 (24:1) 重复步骤2。
  4. 取上清液转移到另一干净的50 ml离心管,加入15 ml冷冻 (-20 °C) 的异丙醇,轻轻摇匀后于-20 °C冷冻半小时,4,000 x g离心10 min。弃上清液,加入5 ml 76%的乙醇浸泡5 h (或过夜),中途换76%的乙醇2-3次。
  5. 弃乙醇风干沉淀约半小时,加入3.0 ml TE缓冲液溶解沉淀,加入20 µl RNase A,轻轻摇匀,37 °C温浴3 h (或过夜),中途轻轻摇匀3-5次。
  6. 将溶液转入10 ml离心管中,加入3.0 ml苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) (用下层有机相) 充分颠倒混匀10 min,4,000 x g离心15 min,吸上清液于另一10 ml的离心管中。(此步骤可酌情重复一次)
  7. 加入1 ml 5.0 M的NaCl和3.0 ml水饱和乙醚 (用上层有机相),轻摇充分混匀10 min,4,000 x g离心5 min。
  8. 用移液器吸出上层乙醚弃掉,用1 ml枪头挡住离心管管口内侧,用力下压枪头,使枪头与管壁间形成一狭缝,堵住中间层胶状物,让下清液从缝中流入另一10 ml离心管。
  9. 加入5 ml冷冻 (-20 °C) 的异丙醇,轻轻摇匀后于-20 °C冰箱冷冻半小时,4,000 x g离心10 min。弃上清液,加入3 ml 70%的乙醇浸泡4-6 h (或过夜),中途换70%乙醇2-3次。风干乙醇,加入100 µl TE溶解DNA。
  10. 取DNA原液1 µl用NanoDrop1000测定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值及DNA浓度。
    注:高质量的DNA要求:A260/A230 > 2.0;1.7 < A260/A280 < 1.9。
  11. 根据DNA浓度取1 μg DNA原液稀释至5 μl后,用1x TAE,1.2%琼脂糖凝胶5 V/cm电泳20 min,凝胶成像仪拍照保存。高质量的DNA呈现大于10 kb的单一条带,点样孔干净无污染、泳道无拖带。

注意事项

  1. 提取过程使用的离心管、枪头都要灭菌 (121 °C,15 min) 烘干备用。
  2. DNA是大分子长片段,整个提取过程动作要轻柔,防止DNA分子断裂降解。
  3. 需要大量高质量基因组DNA时,用新鲜的成熟叶片提取DNA较好,幼嫩叶片果胶含量较高,不利于纯化。

溶液配方

  1. 1 M Tris-HCl (pH 8.0)
    称取Tris-Base 121 g,加入约800 ml水在磁力搅拌器上搅拌,使其充分溶解后加入浓盐酸调pH至8.0后加水定溶至1,000 ml,灭菌 (121 °C,15 min) 后于室温保存
  2. 0.5 M EDTA (pH 8.0)
    称取EDTA-Na2盐187 g加入约800 ml水,在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH,当EDTA和NaOH均完全溶解,溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右,再用pH试纸略加调整即可,灭菌 (121 °C,15 min) 后于室温保存
  3. 5.0 M NaCl
    称取NaCl 300 g,加入蒸馏水约800 ml于磁力搅拌器上充分搅拌,约5分钟后停止搅拌,静止2-3分钟,倒出上清液,再加入100 ml蒸馏水重复前面的步骤,直到NaCl充分溶解后定溶至1,000 ml,灭菌 (121 °C,15 min) 后于室温保存
  4. CTAB buffer
    DNA Buffer (1,000 ml)

    灭菌后于室温下保存3个月左右,使用时取适量Buffer按2%比例 (每100 ml Buffer加入2 g CTAB) 加入CTAB,65 °C水浴锅中充分溶解;在通风橱里加入1%的巯基乙醇 (现配现用)
  5. 氯仿:异戍醇 (24:1)
    500 ml氯仿中加入21 ml异戊醇,混匀,棕色瓶中常温保存
  6. 76%无水乙醇
    380 ml无水乙醇中加入120 ml双蒸水,再加入0.385 g NH4Ac,混匀
  7. TE缓冲液 (100 ml)

  8. 酚:氯仿:异戍醇 (25:24:1)
    Tris-饱和酚与氯仿:异戍醇 (24:1) 以1:1的比例等体积混合,棕色瓶中4 °C冰箱保存,使用时取下层
  9. 水饱和乙醚
    无水乙醚与双蒸水等体积混匀,静置分层,上层为水饱和乙醚
  10. 70%乙醇
    350 ml无水乙醇与150 ml双蒸水混匀

参考文献

  1. Cheng, Y., Yi, H., Pang, X., Guo, W. and Deng, X. (2001). An efficient method for genomic DNA extraction from woody fruit plants. J Huazhong Agric Univ 20 (5): 481-483. (in Chinese)
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:徐远涛, 余惠文, 程运江, 徐强, 邓秀新. (2018). 高纯度柑橘基因组DNA提取与检测. Bio-101: e1010199. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010199.
How to cite: Xu, Y. T., Yu, H. W., Cheng, Y. J., Xu, Q. and Deng, X. X. (2018). Extraction and Detection of High-purity Genomic DNA from Citrus. Bio-101: e1010199. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010199.
Q&A

Please login to post your questions/comments. Your questions will be directed to the authors of the protocol. The authors will be requested to answer your questions at their earliest convenience. Once your questions are answered, you will be informed using the email address that you register with bio-protocol.
You are highly recommended to post your data including images for the troubleshooting.

You are highly recommended to post your data (images or even videos) for the troubleshooting. For uploading videos, you may need a Google account because Bio-protocol uses YouTube to host videos.