Identification of Citrus Pollen Vitality    

材料与试剂

1. 载玻片
   
2. 吸管
   
3. 盖玻片
   
4. 滤纸
   
5. 量筒
   
6. 棕色瓶
   
7. 柑橘花粉
   
8. 柑橘花药
   
9. 碘化钾
   
10. 蒸馏水
    
11. 碘
    
12. TTC
    
13. 1%醋酸洋红 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 毛笔
   
2. 镊子
   
3. 万能显微镜 (Olympus, model: BX61) 
   
4. 电子天平
   

实验步骤

1. 醋酸洋红染色法
   1.1

   在载玻片上用吸管滴一滴1%醋酸洋红，用毛笔轻蘸烘干的柑橘花粉，轻轻洒在醋酸洋红上。
   
   1.2

   盖上盖玻片，盖时用镊子夹住盖玻片一角，使之倾斜与载玻片呈30-45°，缓慢放下盖玻片，防止气泡产生，并用滤纸吸干多余的醋酸洋红。
   注：盖盖玻片时，若产生气泡会影响显微镜观察和拍照，多余的醋酸洋红会使花粉移动，也不利于显微镜观察和拍照。
   
   1.3

   染色一分钟后，于万能显微镜下观察拍照。每个品种3-4个重复，每个重复选取多个视野拍照，保证总花粉数多于500个。用软件Image J统计花粉染色数量与总的花粉数量，计算比值即为花粉活力。
   
2. I-IK染色法：此方法适用于不含淀粉的不育花粉，只染成蓝紫色表明花粉发育良好、活性强，呈黄褐色为发育不良的花粉。
   2.1

   取1 g的碘化钾溶于10 ml蒸馏水中，然后加入0.5 g碘，待全部溶解后，再加蒸馏水至200 ml，配好试剂后，置于棕色瓶中备用。
   
   2.2

   将一滴I-IK溶液滴在载玻片上，用毛笔均匀撒上花粉，盖盖玻片，放置1-2 min进行统计，方法同醋酸洋红染色法。
   
3. TTC染色法：具有生命力的生物体在脱氧酶催化的氧化还原反应中，把氧转移给TTC，使其生成红色的苯甲潜 (TTFC)，因此，凡染为红色的花粉粒是具有活力 的，呈淡红色的活力较低，无色的是没有生命力的。
   3.1

   用镊子在载玻片上放10粒花药，滴蒸馏水1-2滴，用镊子夹出花药，清除花药壁后，滴0.5% TTC 1-2滴，盖上盖玻片，于黑暗中染色30 min。
   
   3.2

   每个处理做1-3个重复，染色完毕后显微镜下观察着色情况。每个重复选取6个视野拍照，进行统计，方法同醋酸洋红染色法。
   

溶液配制

1. 1%醋酸洋红
   洋红1 g，45%醋酸100 ml，煮沸2 h左右，并不断补充蒸馏水，保证其总体积不变，之后冷却过滤，加入4%铁明矾 (硫酸铁铵) 溶液1-2滴 (不能加多，否则会发生沉淀)，放入棕色瓶中常温保存备用