Quantitative Detection of Apoptosis in Rice–comet Assay   

材料与试剂

1. 离心管
   
2. 载玻片
   
3. 玻璃平皿 (5 cm直径)
   
4. 尼龙滤膜 (Millipore，孔径100 nm)
   
5. 水稻突变体(osapi5-1)
   
6. 水稻品种中花11
   
7. 冰
   
8. 低熔点琼脂糖
   
9. Comet Assay Reagent Kit (Trevigen，catalog number: 4250-050-K)
   
10. 1x PBS (Ca离子和Mg离子free，非常重要)
    
11. 1.2% (w/v) NaOH
    
12. 1x TBE
    
13. 70%的乙醇
    
14. 1x TE
    
15. 甘油
    

注：化学试剂全部购自sigma公司，除了乙醇和甘油。

仪器设备

1. 冰箱
   
2. 手术刀
   
3. 普通水平DNA电泳设备
   
4. 荧光显微镜(Leica DM4000B with CCD camera Leica DFC480)
   

实验步骤

1. 取1 ml预冷的1x PBS(含有20 mM EDTA)于预先置冰上的玻璃平皿内，分别取野生型和突变体的处于小孢子早期的30朵小花的花药置于1x PBS中 (至少设置3个生物学重复)。
   
2. 用手术刀将花药尽量切碎在PBS中，制成细胞悬浮液 (该过程一直保持置冰上操作)。
   
3. 用尼龙滤膜过滤刚制好的细胞悬浮液，收集滤液于用冰预冷的1.5 ml离心管内。
   
4. 取30 μl的过滤液和300 μl的1%的低熔点琼脂糖 (37 °C预热)混匀，取70 μl凝胶和样品的混合液点到处理过的载玻片上 (“Comet Assay Reagent Kit”试剂盒内提供)，每个载玻片上点3个点，置4 °C冰箱内，10 min，使凝胶凝固。
   
5. 将凝固好的载玻片浸入用冰预冷的Lysis buffer (试剂盒内提供)，4 °C冰箱内放置45 min。
   
6. 去除载玻片上多余的Buffer，将载玻片浸入新配的1.2% (w/v) NaOH (含有1 mM EDTA)中，室温处理40 min。
   
7. 小心去掉多余的NaOH溶液，将载玻片浸入1x TBE中，放置5 min，再重复该步骤一次。
   
8. 小心去掉多余的Buffer，将载玻片缓慢放入DNA水平电泳槽，电压：1 V/cm，电泳10 min。
   
9. 将电泳完成的载玻片浸入70%的乙醇中，放置5 min。
   
10. 去掉多余的乙醇，风干载玻片上的包含了样品的凝胶，使所有细胞处于同一平面，便于显微观察。
    
11. 染色，取50 μl预先稀释好的SYBR Green I(试剂盒提供，稀释10,000倍)点到样品上，室温黑暗中放置5 min，将多余的染料收集到废液缸内，黑暗中风干载玻片。
    
12. 载玻片上加一滴甘油，盖盖玻片。
    
13. 荧光显微镜下观察，40或60倍物镜下拍照 (图1A-1D)，所有图片保存或转换为bmp格式，便于后期数据处理。
    
14. 在网站http://autocomet.com/details.php下载cometscore软件，将所拍图片导入该软件，选定“彗星”区域，软件会自动算出尾部DNA所占整个细胞DNA的含量(T%)，该值为定量评价每个细胞的DNA片段化程度的指标，每次实验推荐至少随机分析100个细胞。
    
15. 选4种典型的DNA片段化的细胞，即无DNA片段化、低程度片段化、中等程度片段化和严重的片段化，首先算出这4种细胞的T%值范围，这4种细胞分别赋值为0 (无DNA片段化)，1 (低程度片段化)，2 (中等程度片段化)和3 (严重的片段化)，参照这一标准，再将以计算过T%的100个细胞分别赋相应的值，将100个细胞的赋值相加即是该处理样品的DNA片段化程度值(图1E)。
    

结果与分析

Comet assay检测野生型中花11和osapi5-1突变体不同发育时期花药的DNA片段化程度(图1A, 1B, 1C, 1D)。


图1. Comet assay检测野生型中花11和osapi5-1突变体不同发育时期花药的DNA片段化程度。A. 小孢子早期野生型中花11花药单细胞电泳后染色结果。B. 小孢子早期osapi5-1突变体花药单细胞电泳后染色结果。C. 液泡化花粉期野生型中花11花药单细胞电泳后染色结果。D. 液泡化花粉期osapi5-1突变体花药单细胞电泳后染色结果。E. 利用软件定量分析单细胞电泳后每个细胞的DNA断裂程度(拖尾的DNA占总DNA的含量，T%)，将每个细胞算出的T%小于10%赋值为0，介于10%-20%赋值为1，20%-30%赋值为2，30%以上的赋值为3，每次材料随机选取100个细胞核，计算其赋值的总值，该值代表该材料的DNA片段化程度。每个时期的材料做3次生物学重复。