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水稻细胞超微结构的透射电镜观察   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:根据固定剂和包埋剂对水稻细胞结构的原位固定和保存,利用高分辨率的透射电子显微镜对水稻细胞进行成像和观察。
实验目的:可以观察水稻细胞的超微结构、亚细胞器 (细胞核、叶绿体、线粒体、内质网、过氧化酶体及其他质体) 的结构。

关键词: 透射电镜, 超微结构, 水稻细胞

材料与试剂

  1. 2 ml离心管
  2. 吸管
  3. 注射器
  4. 牙签
  5. 细毛笔
  6. 滤纸
  7. NaH2PO4·2H2O
  8. Na2HPO4·12H2O
  9. 戊二醛
  10. 锇酸
  11. Epon812 (SPI, USA)
  12. DDSA
  13. NMA
  14. DMP-30
  15. 醋酸铀
  16. 硝酸铅Pb(NO3)2 
  17. 柠檬酸三钠 (Na2C6H5O7·2H2O)
  18. 氢氧化钠
  19. 丙酮 (国药试剂)
  20. 固定剂 (见溶液配方)
  21. 0.1 M pH 7.2 PBS缓冲液 (见溶液配方)
  22. 脱水剂 (见溶液配方)
  23. 包埋剂 (见溶液配方)
  24. 染色液 (见溶液配方)
    1)
    醋酸铀染液
    2)
    柠檬酸铅染液

仪器设备

  1. 烘箱 (温度范围25-100 °C,国产)
  2. 磁力搅拌器 (国产)
  3. 干燥器 (国产)
  4. 冰箱
  5. 玻璃刀制刀机 (Leica KMR3,Germany)
  6. 钻石刀 (超薄级,DiTOME,Switzerland)
  7. 超薄切片机 (Leica UC6,Germany)
  8. 透射电子显微镜 (H-7650,Japan)
  9. 用具:手术剪刀、眼科镊子、量筒、烧杯、包埋模具、酒精灯、玻璃条、铜网、铜网镊子

实验步骤

  1. 取样:将水稻组织切成1 mm3的小块,每份样品至少取20个小块,迅速置于2.5%戊二醛固定液中,抽真空至样品沉底后再继续抽2 h,4 °C固定一周以内。不同水稻组织取样要求:组织要在固定液中剪切。叶片切成1 x 1 mm小块,花药两端剪开,幼嫩组织取大些但不能超过3 mm3,其他含硅的组织剪的越小越好。
  2. 清洗:将样品块0.1 M PBS洗3次,每次30 min。
  3. 后固定:将样品块放入1%锇酸溶液,室温固定2 h。
    注意:锇酸剧毒!一定要在通风橱内操作。以下所有步骤都要在通风橱内操作。
  4. 清洗:0.1 M PBS洗3次,每次30 min。
  5. 梯度脱水:依次更换30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%丙酮溶液,每个梯度室温放置30 min。
    注意:更换100%丙酮时,速度要快!
  6. 树脂渗透:室温下,依次更换5:1、3:1、1:1、1:3、1:5的纯丙酮与Epon812包埋剂的混合液,每个梯度作用12 h。再更换纯包埋剂,作用12 h。
  7. 包埋聚合:在包埋磨具中加入0.5 ml左右包埋剂,用干燥牙签将样品块放入包埋孔子并定位到合适的位置,缓缓注入包埋剂至包埋孔满。然后放入烘箱进行聚合(使包埋剂固化),温度及时间依次为:45 °C 12 h;60 °C 24-72 h。
  8. 超薄切片:将包埋块粗修暴露出样品,再用玻璃刀细修成梯形;安装钻石刀,对刀,进刀进行切片,将样品切成厚度为60-80nm的切片,铜网捞片,自然晾干。
  9. 染色:在干净的培养皿内放置蜡板,把醋酸铀液滴到蜡板上,将铜网覆于染液上30 min,然后用双蒸水冲洗、吸干。再将铜网覆于柠檬酸铅染液上10 min。再用双蒸水冲洗,吸干。
  10. 透射电镜观察:将铜网固定于样品杆上,样品杆插入透射电镜,加高压,同时打开CCD成像系统。低倍找到切片上的样品,选择感兴趣的区域进行聚焦成像,CCD成像系统获得相应的数码照片。

溶液配方

  1. 固定剂
    2.5%戊二醛
    1%锇酸 (0.1 M PBS, pH 7.2配制)
    注意:锇酸剧毒!
  2. 0.1 M PBS, pH 7.2缓冲液
    A液:NaH2PO4.2H2O 31.21g 定容到1,000 ml
    B液:Na2HPO4.12H2O 71.64g 定容到1,000 ml
    取A液28 ml,B液72 ml配制成0.2 M PBS缓冲液,然后用蒸馏水稀释成0.1 M的工作液
  3. 脱水剂
    丙酮的水溶液 (30%、50%、70%、80%、90%、100%)
  4. 包埋剂 (10个样品的用量)
    DDSA 1 g
    NMA 6 g
    Epon812 7 g
    磁力搅拌8 h (注意勿产生气泡)
    再加入DMP-30 2.5 ml 继续搅拌8 h,干燥器内室温保存
  5. 染色液
    1)
    醋酸铀染液
    使用双蒸水将醋酸铀配成0.5%的水溶液,醋酸铀溶解需15-30 min
    2)
    柠檬酸铅染液
    硝酸铅Pb(NO3)2 1.33 g
    柠檬酸三钠Na2C6H5O7·2H2O 1.76 g
    去二氧化碳的双蒸水 30 ml
    上述成分混合于50 ml的容量瓶中,用力震荡1 min后,间歇震荡30 min,当溶液出现均匀的乳白色悬浮液时,加入1 M氢氧化钠8 ml,溶液变成无色透明,再加水至50 ml。紧塞瓶口,4 °C冰箱保存,如出现浑浊沉淀即不能使用

Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:曹剑波, 程珂, 袁猛. (2018). 水稻细胞超微结构的透射电镜观察. Bio-101: e1010145. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010145.
How to cite: Cao, J. B., Cheng, K. and Yuan, M. (2018). Ultrastructure Obeservation of Rice Cells by Transmission Electron Microscopy. Bio-101: e1010145. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010145.
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