Ultrastructure Obeservation of Rice Cells by Transmission Electron Microscopy   

材料与试剂

1. 2 ml离心管
   
2. 吸管
   
3. 注射器
   
4. 牙签
   
5. 细毛笔
   
6. 滤纸
   
7. NaH₂PO₄·2H₂O
   
8. Na₂HPO₄·12H₂O
   
9. 戊二醛
   
10. 锇酸
    
11. Epon812 (SPI, USA)
    
12. DDSA
    
13. NMA
    
14. DMP-30
    
15. 醋酸铀
    
16. 硝酸铅Pb(NO₃)₂ 
    
17. 柠檬酸三钠 (Na₂C₆H₅O₇·2H₂O)
    
18. 氢氧化钠
    
19. 丙酮 (国药试剂)
    
20. 固定剂 (见溶液配方)
    
21. 0.1 M pH 7.2 PBS缓冲液 (见溶液配方)
    
22. 脱水剂 (见溶液配方)
    
23. 包埋剂 (见溶液配方)
    
24. 染色液 (见溶液配方)
    1)

    醋酸铀染液
    
    2)

    柠檬酸铅染液

仪器设备

1. 烘箱 (温度范围25-100 °C，国产)
   
2. 磁力搅拌器 (国产)
   
3. 干燥器 (国产)
   
4. 冰箱
   
5. 玻璃刀制刀机 (Leica KMR3，Germany)
   
6. 钻石刀 (超薄级，DiTOME，Switzerland)
   
7. 超薄切片机 (Leica UC6，Germany)
   
8. 透射电子显微镜 (H-7650，Japan)
   
9. 用具：手术剪刀、眼科镊子、量筒、烧杯、包埋模具、酒精灯、玻璃条、铜网、铜网镊子
   

实验步骤

1. 取样：将水稻组织切成1 mm³的小块，每份样品至少取20个小块，迅速置于2.5%戊二醛固定液中，抽真空至样品沉底后再继续抽2 h，4 °C固定一周以内。不同水稻组织取样要求：组织要在固定液中剪切。叶片切成1 x 1 mm小块，花药两端剪开，幼嫩组织取大些但不能超过3 mm³，其他含硅的组织剪的越小越好。
   
2. 清洗：将样品块0.1 M PBS洗3次，每次30 min。
   
3. 后固定：将样品块放入1%锇酸溶液，室温固定2 h。
   注意：锇酸剧毒！一定要在通风橱内操作。以下所有步骤都要在通风橱内操作。
   
4. 清洗：0.1 M PBS洗3次，每次30 min。
   
5. 梯度脱水：依次更换30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%丙酮溶液，每个梯度室温放置30 min。
   注意：更换100%丙酮时，速度要快！
   
6. 树脂渗透：室温下，依次更换5:1、3:1、1:1、1:3、1:5的纯丙酮与Epon812包埋剂的混合液，每个梯度作用12 h。再更换纯包埋剂，作用12 h。
   
7. 包埋聚合：在包埋磨具中加入0.5 ml左右包埋剂，用干燥牙签将样品块放入包埋孔子并定位到合适的位置，缓缓注入包埋剂至包埋孔满。然后放入烘箱进行聚合(使包埋剂固化)，温度及时间依次为：45 °C 12 h；60 °C 24-72 h。
   
8. 超薄切片：将包埋块粗修暴露出样品，再用玻璃刀细修成梯形；安装钻石刀，对刀，进刀进行切片，将样品切成厚度为60-80nm的切片，铜网捞片，自然晾干。
   
9. 染色：在干净的培养皿内放置蜡板，把醋酸铀液滴到蜡板上，将铜网覆于染液上30 min，然后用双蒸水冲洗、吸干。再将铜网覆于柠檬酸铅染液上10 min。再用双蒸水冲洗，吸干。
   
10. 透射电镜观察：将铜网固定于样品杆上，样品杆插入透射电镜，加高压，同时打开CCD成像系统。低倍找到切片上的样品，选择感兴趣的区域进行聚焦成像，CCD成像系统获得相应的数码照片。
    

溶液配方

1. 固定剂
   2.5%戊二醛
   1%锇酸 (0.1 M PBS, pH 7.2配制)
   注意：锇酸剧毒！
   
2. 0.1 M PBS, pH 7.2缓冲液
   A液：NaH₂PO₄.2H₂O 31.21g 定容到1,000 ml
   B液：Na₂HPO₄.12H₂O 71.64g 定容到1,000 ml
   取A液28 ml，B液72 ml配制成0.2 M PBS缓冲液，然后用蒸馏水稀释成0.1 M的工作液
   
3. 脱水剂
   丙酮的水溶液 (30%、50%、70%、80%、90%、100%)
   
4. 包埋剂 (10个样品的用量)
   DDSA 1 g
   NMA 6 g
   Epon812 7 g
   磁力搅拌8 h (注意勿产生气泡)
   再加入DMP-30 2.5 ml 继续搅拌8 h，干燥器内室温保存
   
5. 染色液
   1)

   醋酸铀染液
   使用双蒸水将醋酸铀配成0.5%的水溶液，醋酸铀溶解需15-30 min
   
   2)

   柠檬酸铅染液
   硝酸铅Pb(NO₃)₂ 1.33 g
   柠檬酸三钠Na₂C₆H₅O₇·2H₂O 1.76 g
   去二氧化碳的双蒸水 30 ml
   上述成分混合于50 ml的容量瓶中，用力震荡1 min后，间歇震荡30 min，当溶液出现均匀的乳白色悬浮液时，加入1 M氢氧化钠8 ml，溶液变成无色透明，再加水至50 ml。紧塞瓶口，4 °C冰箱保存，如出现浑浊沉淀即不能使用