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水稻细胞表面和截面的扫描电镜观察   

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Original research article

实验原理:根据固定剂对水稻细胞结构的原位固定和保存,利用临界点干燥对样品的无损脱水干燥,达到扫描电镜的观察条件后,对组织表面和截面进行观察。
实验目的:可以观察水稻组织表面的特殊结构(气孔、硅突等)、细胞表面结构及细胞大小。

关键词: 扫描电镜, 表面结构, 水稻组织


材料与试剂

  1. 2 ml离心管
  2. 吸管
  3. 注射器
  4. 牙签
  5. 滤纸
  6. 水稻组织
  7. 无水乙醇 (国药试剂)
  8. 醋酸异戊酯 (国药试剂)
  9. 液态二氧化碳 (国药试剂)
  10. 戊二醛 (进口品质试剂)
  11. 0.1 M PBS, pH 7.2缓冲液 (见溶液配方)
  12. 脱水剂 (见溶液配方)
  13. 固定剂 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 通风橱
  2. 干燥器 (国产)
  3. 冰箱
  4. 临界点干燥仪 (HITACHI HCP-2,Japan)
  5. 离子溅射仪 (JEOL JFC-1600,Japan)
  6. 扫描电镜 (JEOL JSM-6390/LV,Japan)
  7. 用具:手术剪刀、眼科镊子、量筒、烧杯、小笼子

实验步骤

  1. 取样:目的水稻组织切成9 mm3的小块,每份样品至少取10个小块,迅速置于2.5%戊二醛固定液中,抽真空2 h,4 °C或室温固定一周以内。不同水稻组织取样要求:组织要在固定液中剪切。叶片切成3 x 3 mm小块;观察花粉粒直接取花药进行固定,粘样后再将花粉粒拨出;观察花原基或叶原基最好是将花序或叶序固定后再拨出原基。
  2. 脱水:依次通过乙醇梯度30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%逐级脱水每级10 min,样品块大的应适当摇动,保证脱水干净。70%乙醇中可以放过夜。
  3. 醋酸异戊酯替换:醋酸异戊酯:乙醇=1:1的混合液浸泡样品10 min,再用纯醋酸异戊酯浸泡10 min,适当摇动。将样品按照不同的编号转入对应编号的小笼子。醋酸异戊酯有刺激性气味,此步要在通风橱内操作。
  4. 临界点干燥:提前打开临界点干燥仪预冷1 h以上。将装有样品的小笼子放进预冷的临界点干燥仪样品室内,充分拧紧样品室盖子后注入液体二氧化碳至淹没样品为准,先升温至15 °C加温10 min,再升温至35 °C让二氧化碳气化,观察液体全部气化后慢慢放气。放气速度一定要慢,放气过程至少要持续3 h以上。必须等气体放净后才能开盖取出样品。
  5. 粘样:样品台上粘双面的导电胶,将要观察的样品表面向上粘在导电胶上。粘样时,不能碰到要观察样品的表面。要观察截面的样品,用双面剃须刀片滑切出样品截面,截面向上将样品薄片粘在导电胶上。
  6. 喷金:将样品台放在离子溅射仪中,打开仪器开始抽真空,当真空达到5.0 Pa后,点start按钮进行喷金。
  7. 扫描电镜观察:样品台固定在样品座上,放入扫描电镜样品仓,抽真空待HT变蓝后,加高压,选择感兴趣区域放大聚焦,SCAN3慢扫获得照片。

注意事项

  1. 水稻叶片正面反面有较大差异,粘样时注意正反。
  2. 观察水稻叶片气孔取样植株最好在苗期,较老植株微管组织发达,气孔内陷及表面附属物很多不易观察气孔开闭。
  3. 水稻叶片抽真空不易下沉,可先用纱布塞在上面将叶片在液面以下,再反复抽真空几次直至叶片自然沉入管底。
  4. 观察水稻茎端分生组织,剥去外面叶片及叶鞘时应非常细心,极易破损或剥离不完全。

溶液配方

  1. 0.1 M PBS, pH 7.2缓冲液
    A液:NaH2PO4.2H2O 31.21 g 定容到1,000 ml
    B液:Na2HPO4.12H2O 71.64 g 定容到1,000 ml
    取A液28 ml,B液72 ml配制成0.2M PBS缓冲液,然后用蒸馏水稀释成0.1 M的工作液
  2. 脱水剂
    30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和无水乙醇
  3. 固定剂
    2.5%戊二醛 (进口品质试剂,0.1 M PBS, pH 7.2配制)
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:曹剑波, 都浩, 袁猛. (2018). 水稻细胞表面和截面的扫描电镜观察. Bio-101: e1010144. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010144.
How to cite: Cao, J. B., Du, H. and Yuan, M. (2018). Observation of Cell Surface and Cross-sectional Structure of Rice Tissue by Scanning Electron Microscopy. Bio-101: e1010144. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010144.
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