水稻总蛋白抽提   

材料与试剂

1. 1.5 ml离心管
   
2. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
   
3. 液氮
   
4. 1 M Tris-HCl (固体Tris碱配制，浓盐酸调节pH)
   
5. SDS
   
6. 甘油
   
7. β-巯基乙醇
   
8. 溴酚蓝
   
9. 5 M NaCl (固体配制，国药集团)
   
10. Triton X-100 (上海生工分装进口试剂)
    
11. Protease Inhibitor (Roche, catalog number: 11836153001)
    
12. 总蛋白抽提缓冲液 (见溶液配方)
    
13. 4x Laemmli buffer (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液枪 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
   
2. 天平
   
3. 高速冷冻离心机
   
4. 研钵
   

实验步骤

1. 取200 μl总蛋白抽提缓冲液加入到1.5 ml离心管中，放在冰上待用。
   
2. 液氮研磨水稻叶片，取大约0.1 g粉末，加入到200 μl缓冲液中，充分混匀。
   
3. 12,000 rpm冷冻离心10 分钟。
   
4. 取上清，以3:1加入4x Laemmli buffer，混匀后95度以上变性10分钟,冰上冷却5分钟。
   
5. 室温12,000 rpm 5分钟，取上清进行 SDS-PAGE检测。
   注：本方法操作简单且蛋白抽提彻底，但是电泳过程中杂质较多，大分子量蛋白条带不清晰。
   
6. 本实验方法可简化为：
   将用液氮磨好的粉末以0.1 g/200 μl的比例直接加入到1x Laemmli buffer中，混匀后95度以上变性10分钟，离心取上清即为变性后的总蛋白，可直接用于SDS-PAGE检测。
   

溶液配方

1. 4x Laemmli buffer
   
   注：溴酚蓝可不必称量，边加边观察颜色变化，适量即可，过多会导致颜色偏红。
   
2. 总蛋白抽提缓冲液
   
   注：若抽提出的总蛋白直接用于SDS-PAGE检测，可以用SDS代替Triton X-100，由于SDS的变性能力比Triton X-100强，可以更好的将核内的蛋白也抽提出；如提取的总蛋白是用于蛋白或复合体的分离纯化，则不能使用SDS。