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水稻总蛋白抽提   

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简要原理:以去污剂和盐离子破坏膜结构,释放出总蛋白。本方法操作简单,且蛋白抽提彻底。

关键词: 总蛋白, 水稻, 粗提

材料与试剂

  1. 1.5 ml离心管
  2. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
  3. 液氮
  4. 1 M Tris-HCl (固体Tris碱配制,浓盐酸调节pH)
  5. SDS
  6. 甘油
  7. β-巯基乙醇
  8. 溴酚蓝
  9. 5 M NaCl (固体配制,国药集团)
  10. Triton X-100 (上海生工分装进口试剂)
  11. Protease Inhibitor (Roche, catalog number: 11836153001)
  12. 总蛋白抽提缓冲液 (见溶液配方)
  13. 4x Laemmli buffer (见溶液配方)

仪器设备

  1. 移液枪 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
  2. 天平
  3. 高速冷冻离心机
  4. 研钵

实验步骤

  1. 取200 μl总蛋白抽提缓冲液加入到1.5 ml离心管中,放在冰上待用。
  2. 液氮研磨水稻叶片,取大约0.1 g粉末,加入到200 μl缓冲液中,充分混匀。
  3. 12,000 rpm冷冻离心10 分钟。
  4. 取上清,以3:1加入4x Laemmli buffer,混匀后95度以上变性10分钟,冰上冷却5分钟。
  5. 室温12,000 rpm 5分钟,取上清进行 SDS-PAGE检测。
    注:本方法操作简单且蛋白抽提彻底,但是电泳过程中杂质较多,大分子量蛋白条带不清晰。
  6. 本实验方法可简化为:
    将用液氮磨好的粉末以0.1 g/200 μl的比例直接加入到1x Laemmli buffer中,混匀后95度以上变性10分钟,离心取上清即为变性后的总蛋白,可直接用于SDS-PAGE检测。

溶液配方

  1. 4x Laemmli buffer

    注:溴酚蓝可不必称量,边加边观察颜色变化,适量即可,过多会导致颜色偏红。
  2. 总蛋白抽提缓冲液

    注:若抽提出的总蛋白直接用于SDS-PAGE检测,可以用SDS代替Triton X-100,由于SDS的变性能力比Triton X-100强,可以更好的将核内的蛋白也抽提出;如提取的总蛋白是用于蛋白或复合体的分离纯化,则不能使用SDS。
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:陈香嵩, 程赛凤, 周少立, 赵毓. (2018). 水稻总蛋白抽提. Bio-101: e1010120. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010120.
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