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RNA原位杂交   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理和目的:RNA原位杂交是基于反义RNA与靶基因RNA的碱基配对原理,利用地高辛标记的反义RNA为探针,与切片杂交,从而原位显示RNA的表达部位和相对丰度。RNA原位杂交是研究基因表达谱的重要方法。

关键词: RNA原位杂交, 石蜡切片, 转录, 杂交

材料与试剂

  1. 进口离心管 (RNase-free)
  2. A4纸
  3. 切片盒
  4. 载玻片
  5. 手帕 (普通无尘手帕,用于拭去载玻片表面灰尘)
  6. 玻璃瓶
  7. 纸盒
  8. 面巾纸
  9. Parafilm
  10. 无水乙醇
  11. 二甲苯
  12. 石蜡
  13. 碱水
  14. DEPC-H2O
  15. 0.1% poly-L-lysine溶液 (Sigma或生工,RNase free)
  16. Tris饱和的苯酚
  17. 氯仿(CHCl3)
  18. NaAc
  19. DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Roche, catalog number: 1 175 025)
  20. DIG Wash and Block Buffer Set (Roche, catalog number: 1 585 762)
  21. DNase I (Invitrogen,catalog number: 18068-015)
  22. EDTA
  23. LiCl
  24. 冰乙酸
  25. NcoI酶 (可根据需要选择其他内切酶)
  26. SP6转录酶
  27. SalI酶 (可根据需要选择其他内切酶)
  28. T7转录酶
  29. Glycine
  30. 甲醛
  31. Tris base
  32. 浓盐酸
  33. EDTA-2Na
  34. NaOH
  35. MgCl2·6H2O
  36. NaCl
  37. NaH2PO4
  38. Na2HPO4
  39. Yeast tRNA (Invitrogen, catalog number: 15401029)
  40. Proteinase K buffer
  41. Proteinase K (Invitrogen, catalog number: 25530049)
  42. PBS
  43. 去离子甲酰胺
  44. BSA
  45. Triton X-100
  46. 50% FAA固定液 (见溶液配方)
  47. 70% FAA固定液 (见溶液配方)
  48. 1 M Tris-HCl (pH 7.5) (见溶液配方)
  49. 1 M Tris-HCl (pH 9.5) (见溶液配方)
  50. 0.5 M EDTA-2Na pH 8.0 (见溶液配方)
  51. 1 M MgCl2 (见溶液配方)
  52. 5 M NaCl (见溶液配方)
  53. 20x SSPE pH 7.4 (见溶液配方)
  54. 10x PBS pH 7.4 (见溶液配方)
  55. 50%硫酸葡聚糖(Detran sulfate) (见溶液配方)
  56. 10 mg/ml yeast t-RNA (见溶液配方)
  57. Proteinase K buffer (见溶液配方)
  58. 10x Hybridization salts (见溶液配方)
  59. Prehybridization solution (见溶液配方)
  60. 1x Blocking buffer (见溶液配方)
  61. BSA washing buffer (见溶液配方)
  62. TNM-50 buffer (见溶液配方)

仪器设备

  1. 脱蜡缸
  2. 镊子
  3. 剪刀
  4. 镊子
  5. 切片机
  6. 展片台
  7. 烘箱
  8. 超净工作台
  9. 紫外分光光度计
  10. -20 °C冰箱
  11. 冷冻离心机

实验步骤

  1. 取材、固定、脱水、包埋、切片
    注:所有用到的玻璃器皿要洗净,并180 °C烘6 h,载玻片先用95%乙醇浸泡、擦干净,再180 °C烘6 h;所用的试剂瓶需事先装DEPC-H2O灭过菌;所用的固定液、乙醇溶液等都要用DEPC-H2O配制。
    1.1
    配制FAA固定液(见溶液配方)
    1.2
    取材:将所需材料尽量剪小,加入预冷的FAA固定液中,固定液体积应不少于材料体积的10倍。固定液放冰上,抽真空15 min,缓慢放气,再重复两次,直到材料沉底。
    1.3
    固定:将抽完真空的固定液吸走弃去,换成新的固定液。4 °C固定24 h。
    1.4
    脱水:如果是用50% FAA固定,先用50%乙醇洗掉固定液,换三次,每次30 min;如果是用70% FAA固定,先用70%乙醇洗掉固定液,换三次,每次30 min。然后梯度乙醇脱水(4 °C):

    1.5
    继续脱水和透明(室温)

    1.6
    浸蜡

    1.7
    包埋
    预先折好纸盒,并在电磁炉上熔化新的石蜡,置于60 °C温箱中备用,注意包埋蜡温度不要过高,以免烫坏组织。包埋时,先铺一层包埋蜡,再将玻璃瓶中的材料倒进纸盒中,镊子稍加热,均匀排列材料 (动作尽可能迅速,尤其是包埋蜡之后应尽快进行后续操作)。让材料自然冷却,可第二天再收。蜡块4 °C可以保存很久。注意包埋蜡不要倒太多,蜡块厚度以1-2 cm为宜,太厚不好切片。纯蜡的温度可以提升至63 °C,防治操作过程中不迅速蜡块冷却凝固。
    1.8
    切片前的准备
    切片盒先用碱水浸泡过夜,然后用DEPC·H2O洗净,42 °C烘干。
    用于原位杂交的载玻片必须保证无RNase,我们需要先用95%乙醇浸泡,然后再用干净的手帕擦干,用锡纸包裹后,180 °C烘6 h。如果载玻片本身很干净无浮尘,也可以直接180 °C烘6 h。但是如果载玻片不干净,会影响粘片和封片。
    烘好后的玻片要涂上0.1% poly-L-lysine溶液(Sigma或生工,RNase free)。抹片方法:在超净台上,先铺一张干净的A4纸张,将载玻片正面朝上排成两列摆在纸上(磨砂面方便用铅笔写字,为正面)。在其中一列载玻片中央加20 μl poly-L-lysine,然后依次将滴有poly-L-lysine的和无poly-L-lysine的载玻片面对面涂抹均匀,注意不要有气泡,涂完后放置在干净的切片盒中。37 °C烘干,至少1 h。
    1.9
    切片
    切片前,依次用70%乙醇和DEPC·H2O擦干净切片台面、切片机、展片台。切片厚度一般为8-10 μm (如果不能得到连续蜡带或蜡带中出现较多空洞,可在取材后将材料进一步剪小,并适当延长脱水、透明和浸蜡各步骤的处理时间,使蜡渗透充分)。展片时,先滴1 ml DEPC-H2O在载玻片上,选取需要的切片(光面朝下)漂浮在DEPC-H2O水滴上。小心将载玻片转移到40 °C左右的展片台上,待切片展开就用枪吸走DEPC-H2O,再稍微在展片台放置,甩掉剩余的DEPC-H2O,放入切片盒中。注意展片台温度不能过高,否则会产生气泡,破坏切片。
    注:展片时间也不能过久,超过5 min会导致RNA降解。切好的切片37-42 °C烘干1-2天,就可做杂交。切好的切片不能放置太久,最好其他步骤都准备好了再切片。
  2. 探针的设计与合成
    2.1
    探针的设计原则:
    1)
    探针特异性要好,与其他基因的匹配长度不要超过50 bp;
    2)
    用于杂交的探针长度为150-200 bp,超过此长度的探针需要水解(见后面),用于转录的模板不要超过1.5 Kb;
    3)
    探针的GC含量最好在40-60%,没有连续重复的碱基。
    2.2
    探针模板的克隆与线性化:
    将选取的cDNA片段扩增,克隆在含有T7、SP6启动子的载体上,如p-GEM-T或p-GEM-T Easy载体上。线性化需要用5’突出末端的内切酶,如SalⅠ和NcoⅠ,酶切的质粒量为20-50 μg,酶切体系200 μl,酶切时间2 h至过夜。纯化前,需取1 μl酶切产物跑胶检测,确定酶切完全。
    酶切完毕,需要纯化,以确保模板没有RNase等杂质。纯化在进口离心管中进行,试剂用RNA专用的。纯化步骤如下:
    1)
    将酶切体系补水至500 μl,向其加入250 μl Tris饱和的苯酚和250 μl CHCl3,震荡5 min,12,000 rpm离心5 min。
    2)
    吸上层水相上清,转移至新管中,加500 μl CHCl3,震荡5 min,12,000rpm离心5 min.
    3)
    吸上清,转移至新管中,加1/10体积的3 M NaAc (pH 5.2,DEPC-H2O配),2倍体积的无水乙醇,-20 °C冷冻3 h至过夜。
    4)
    4 °C冷冻离心,12,000 rpm离心15 min。
    5)
    70%乙醇浸洗沉淀,去上清,吹干。
    6)
    加20 μl DEPC-H2O溶解沉淀,测浓度。
    2.3
    探针的转录:
    探针转录用Roche公司的DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7),货号1 175 025。转录所用到的试剂均用DEPC-H2O配制,转录的步骤如下:
    1)
    转录体系:
    线性化的模板 1 μg
    10x Transcription Buffer 2 μl
    10x DIG RNA Labeling Mix 2 μl
    Ribonuclease Inhibitor (TaKaRa) 1 μl
    T7/SP6 RNA Polymerase 2 μl
    补充DEPC·H2O至总体积20 μl,37 °C转录2-2.5 h
    2)
    DNase I (invitrogen) 2.5 μl 37 °C处理15 min,去掉DNA模板。
    3)
    加1 μl 0.5 M EDTA (pH 8.0)终止反应。
    4)
    加2.5 μl 4 M LiCl和75 μl无水乙醇,-20 °C冷冻3 h至过夜。
    5)
    0 °C冷冻离心,12,000 rpm离心20 min。
    6)
    去掉上清,加80%乙醇150 μl浸洗,0 °C冷冻离心,12,000 rpm 离心20min。
    7)
    小心吸走上清,超净台上吹干,加20-40 μl DEPC·H2O溶解。测浓度,跑胶检测,-70 °C保存。如果转录的探针长度合适,就此完成;如果长度过长,探针不易进入细胞,需要碱水解,继续往下进行。
    1. 碱水解的时间计算公式如下:
      T=(L0-Lf)/(K×L0×Lf)
      L0:探针初始长度(Kb);Lf:探针终长度(Kb);K:0.11 Kb/min.
      水解溶液为20 μl 100 mM NaHCO3和30 μl 100 mM Na2CO3,加在总体积为100 μl。水解温度为60 °C,水解时间按上述公式。
    2. 水解后加入5 μl 10%冰乙酸,10 μl 3 M NaAc,2倍体积的无水乙醇,-20 °C冷冻3 h至过夜。
    3. 0 °C冷冻离心,12,000 rpm 离心20 min。
    4. 去掉上清,加80%乙醇150 μl浸洗,0 °C冷冻离心,12,000 rpm 离心20 min。
    5. 重复步骤d。
    6. 小心吸走上清,超净台吹干。溶于20 μl DEPC·H2O,测浓度,跑胶检测。保存于-70 °C。
    2.4
    探针方向的确定:
    用于原位杂交检测的探针是与体内mRNA互补的RNA,称为反义RNA;用于阴性对照的探针是与体内mRNA方向相同的,称为正义RNA。连接入p-GEM-T或p-GEM-T Easy载体的cDNA的方向决定了探针的方向。
    如果cDNA在载体中的连接方向如图1所示时,用NcoⅠ酶切、SP6转录酶转录的探针是反义RNA,用SalⅠ酶切、T7转录酶转录的探针是正义RNA。如果cDNA连接的方向相反,则探针方向也反过来。
    注:这一点非常重要,建议重点强调,这个图示很简明清晰,很好。


    图1. cDNA在载体中的连接方向
  3. 杂交
    3.1
    试剂配制 (见溶液配方)
    3.2
    杂交前的准备:脱蜡缸、镊子、剪刀等要180 °C烘6 h,切片要37-42 °C烘1-2天。10x Blocking solution (3)从-20 °C冰箱拿出解冻 (DIG Wash and Block Buffer Set,Roche)。

    杂交第一天 (步骤3.3-3.7)

    3.3
    脱蜡和复水,通风橱中进行:


    在脱蜡的同时配制并预热Proteinase K buffer (见溶液配方),37 °C温箱中预热。

    3.4
    Proteinase K处理
    Proteinase K稀释到1 μg/ml, 37 °C处理40 min。PBS洗一次,2 mg/ml Glycine浸泡2 min,再次用PBS洗一次。
    3.5
    脱水,用刚才(3.3脱蜡和复水)的溶液:

    超净台上吹干,约30-50 min。
    3.6
    预杂交:
    先配制10x Hybridization salts,可4 °C保存 (见溶液配方)。
    吸50%硫酸葡聚糖需要剪去枪头,配制过程尽量不要产生气泡,有气泡需要离心消泡。预杂交液可以-20 °C保存。
    预杂交时,取150 μl预杂交液滴加在吹干的载玻片上,并用大小合适的干净parafilm覆盖,不能产生气泡。将载玻片转移至离心管盒子中,盒中加DEPC·H2O,盖严以保湿。42°C预杂交1-3 h。
    3.7
    杂交:
    在预杂交液中加入探针,使其浓度为400-1000 ng/ml。取下载玻片上的parafilm,并在面巾纸上吸干,将稀释好的探针滴加150 μl于载玻片上,用parafilm覆盖,放入湿盒中。42°C杂交16-20 h。


    杂交第二天 (步骤3.8-3.14),不再需要用DEPC-H2O配制试剂

    3.8
    2x SSPE洗三次 (见溶液配方)
    第一次揭开parafilm,将玻片浸入2x SSPE中。第二次、第三次,42 °C 15min。
    3.9
    0.2x SSPE洗两次 (见溶液配方)
    57°C杂交炉中,最小转速,30 min,两次。
    3.10
    1x Blocking buffer洗,室温摇床,最小转速,30 min。(见溶液配方)
    3.11
    免疫反应:
    配制BSA washing buffer (200 ml,现配现用,方法见溶液配方)。
    先将Anti-Digoxigenin-AP离心12000 rpm 5min,取上清,稀释在BSA washing buffer(见溶液配方)中,稀释比为1:2500-1:5000,室温杂交2 hrs,最小转速摇晃。
    3.12
    洗抗体:
    BSA washing buffer洗三次,每次15min,最小转速摇晃。
    在此期间配制TNM-50 buffer(120ml)(见溶液配方)
    3.13
    TNM-50 buffer洗三次,每次5 min。
    3.14
    显色反应:
    避光配制显色液,30 ml TNM-50 buffer中加入0.3-0.8 ml NBT/BCIP stock solution (Roche, Cat. No. 1 681 451),依照具体显色情况,避光显色过夜。


    杂交第三天 (步骤3.15-3.18)

    3.15
    待到实验组明显显色而阴性对照没有显色时,将载玻片转移至双蒸水中,洗三次,每次2min。
    3.16
    脱水,用第一天的溶液:

    因为显出的颜色溶于乙醇,所以脱水的过程要比较快,特别是当显出的颜色比较浅的时候,每一级不要超过10 sec。
    3.17
    封片,37 °C烘干。
    3.18
    拍照观察。

溶液配方

  1. 50%FAA固定液 ( 100 ml)
    无水乙醇
    50 ml
    37%甲醛溶液
    10 ml
    冰乙酸
    5 ml
    加DEPC-H2O定容至100 ml
  2. 70% FAA固定液 (100 ml)
    无水乙醇
    70 ml
    37%甲醛溶液
    10 ml
    冰乙酸
    5 ml
    加DEPC·H2O定容至100 ml
    注:50%FAA适用于幼穗、SAM等幼嫩组织的固定,70%FAA适用于根、茎秆、叶片等成熟组织的固定。
  3. 1 M Tris-HCl (pH 7.5) (500 ml)
    Tris base
    60.55 g
    浓盐酸约
    32 ml
    加浓盐酸调pH至7.5
    定容至500 ml
  4. 1 M Tris-HCl (pH 9.5) (300 ml)
    Tris base
    36.33 g
    浓盐酸 1 ml
    加浓盐酸调pH至9.5
    定容至300 ml
  5. 0.5 M EDTA-2Na, pH 8.0 (500 ml)
    EDTA-2Na
    93.06 g
    NaOH约
    10 g
    完全溶解后,调pH至8.0
    定容于500 ml
  6. 1 M MgCl2 (100 ml)
    MgCl2·6H2O
    20.331 g
    定容至100 ml
  7. 5 M NaCl (500 ml)
    NaCl                          
    146.1 g
    定容至500 ml
  8. 20x SSPE, pH 7.4 (1 L)
    NaCl
    175.3 g
    NaH2PO4
    24 g
    0.5 M EDTA (pH 8.0)
    40 ml
    定容至1 L
  9. 10x PBS,pH 7.4 (500 ml)
    NaCl
    38 g
    NaH2PO4
    1.8 g
    Na2HPO4
    4.95 g
    定容至500 ml
  10. 50%硫酸葡聚糖(Detran sulfate)
    Detran sulfate
    5 g
    定容至
    10 ml
    分装至1.5 ml离心管中,保存于-20 °C
    注:50%硫酸葡聚糖比较粘稠,配好之后直接按照需要的量(1 ml)分装到10 ml的离心管中,保存在4度,用的时候可直接往离心管中加其他成分。
  11. 10 mg/ml yeast t-RNA
    25 mg                                
    yeast t-RNA (invitrogen)
    溶于2.5 ml DEPC-H2O中
    注:
    1)
    试剂都要用灭菌的DEPC-H2O配,配试剂用到的量筒需要180 °C烘6 h。
    2)
    4-10在配好后需要灭菌。用时都要在超净台上打开,以免长菌。
  12. Proteinase K buffer (100 ml)
    1 M Tris-HCl (pH 7.5)
    10 ml
    0.5 M EDTA-2Na (pH 8.0)
    10 ml
    DEPC-H2O
    80 ml
  13. 10x Hybridization salts (10 ml)
    1 M Tris-HCl (pH 7.5)
    1 ml
    0.5 M EDTA-2Na (pH 8.0)
    200 μl
    5 M NaCl
    6 ml
    DEPC-H2O
    2.8 ml
  14. Prehybridization solution (10 ml)
    DEPC-H2O
    1.85 ml
    去离子甲酰胺
    5 ml
    10x Hybridization salts
    1 ml
    50%硫酸葡聚糖
    1 ml
    10x Blocking solution (3)
    1 ml
    10 mg/ml yeast t-RNA
    150 μl
  15. 1x Blocking buffer (40 ml,现配现用)
    10x Blocking buffer (3)
    4 ml
    10x Blocking buffer (2)
    3.6 ml
    加ddH2O至
    40 ml
  16. BSA washing buffer (200 ml,现配现用)
    BSA
    2 g
    Triton X-100
    600 μl
    1 M Tris-HCl (pH 7.5)
    20 ml
    5 M NaCl
    6 ml
    加ddH2O至
    200 ml
  17. TNM-50 buffer (120 ml)
    1 M Tris-HCl (pH 9.5)
    12 ml
    5 M NaCl
    2.4 ml
    1 M MgCl2
    6 ml
    加ddH2O至
    120 ml
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:程珂, 陈炯炯, 鄢文豪, 欧阳亦聃. (2018). RNA原位杂交. Bio-101: e1010119. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010119.
How to cite: Cheng, K., Chen, J. J., Yan, W. H. and Ouyang, Y. D.  (2018). RNA in-situ Hybridization. Bio-101: e1010119. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010119.
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