实验原理：根据颈环引物的空间结构来提高反转录的特异性，从而反转录特定的small RNA，在实时定量过程中，打开颈环结构，通过通用引物和特异引物，用SYBR染料，进行定量。
引物设计(仅供参考)：
以>osa-miR171a为例：
miR171a: UGAUUGAGCCGCGCCAAUAUC
RT-primer: 5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAgatattg3’
Forward primer: 5’gcgaTGATTGAGCCGCGCC3’
Reverse primer: 5’GTGCAGGGTCCGAGGT3’
实验目的：检测水稻各种组织中的small RNA的表达量，特别是样品很少的材料。
关键词: Small RNA, Stem-loop RT, Real-time PCR, 颈环结构, SYBR
材料与试剂
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各种规格枪头 (RNase free及一般枪头)
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96孔板
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DEPC水
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DNase I (NEB, catalog number: M0303S)
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SuperScript® III Reverse Transcriptase (Invitrogen, catalog number: 18080-044)
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RR I (Takara, catalog number: D2313A)
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SYBR Premix Ex TaqTM (Takara, catalog number: DRR041A)
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EDTA
仪器设备
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移液器
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9700 PCR仪(ABI)
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7500 Real time PCR仪(ABI)
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离心机
实验步骤
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2.2 μg总RNA稀释到5 μl，加入1 μl DNase I，1 μl DNase I buffer和3 μl DEPC水。于37 °C孵育10 min，加入1 μl 50 mM EDTA，65 °C孵育10 min。将处理好的RNA稀释10倍待用。
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每个反转录反应需0.25 μl引物，0.25 μl dNTP，加上1 μl DEPC水配成混合液。
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在96孔板中加入2 μl RNA和1.5 μl引物混合液。然后稍离心，盖上橡皮盖子。将混合液置于96孔板上65 °C孵育5 min，立即置于冰上3 min。
将1 μl 5x First strand buffer, 0.5 μl 0.1 M DTT, 0.15 μl RR I以及0.15 μl SuperScript III配制成混合液，每管中加入1.8 μl混合液。离心后，放置于PCR仪上，程序如下：
16 °C
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30 min
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50 °C
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30 min
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85 °C
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5 min
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25 °C
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1 min
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将反转录产物置于-20 °C过夜，或者立即进行定量分析。
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将1 μl通用反向引物和1 μl特异正向引物加入1.5 μl灭菌双蒸水，配制成混合液，分加至每管中，并且加入12.5 μl real time试剂。贴上膜后，于离心机中稍微离心。
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放置于ABI 7500中程序如下
95 °C
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10 sec
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95 °C
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5 sec
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60 °C
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34 sec
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后两步40个循环，加上标准溶解曲线程序。
参考文献
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Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., Lao, K. Q., Livak, K. J. and Guegler, K. J. (2005). Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res 33(20): e179.
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