Small RNA分离及PAGE-northern   

How to cite Favorites Q&A Share your feedback Cited by

Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:根据变性PAGE胶,分离小片段RNA,然后用同位素标记探针检测目的小RNA。
实验目的:用来验证植物中小RNA的存在,检测小RNA大小,以及表达量分析。

关键词: Small RNA, PAGE-northern, 变性PAGE

材料与试剂

  1. 玻璃板
  2. 各种规格RNase free枪头
  3. 海绵
  4. 滤纸
  5. 保鲜膜
  6. 冰槽
  7. 丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=29:1 (BioRad, catalog number: 161-0156)
  8. N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED) (BioRad, catalog number: 161-0800)
  9. 10%过硫酸铵(AP) (Sigma, catalog number: A7460)
  10. 尿素 (Sigma, catalog number: U6504)
  11. 0.1%溴酚蓝
  12. 0.1%二甲苯青
  13. 8 M尿素
  14. 尼龙膜 (Amershan, catalog number: RPN3038)
  15. T4寡核苷酸激酶 (Takara)
  16. γ-32P-ATP (PerkinElmer, catalog number: BLU002Z250UC)
  17. Tris (Sigma)
  18. 硼酸 (Sigma)
  19. EDTA (FLUKA)
  20. DEPC (Sigma, catalog number: D5758)
  21. 无水乙醇和75%乙醇
  22. 0.01% DEPC水
  23. EB
  24. 氯化钠 (Sigma)
  25. 柠檬酸钠 (Sigma)
  26. 磷酸二氢钠 (Sigma)
  27. 磷酸氢二钠 (Sigma)
  28. PEG8000 (Sigma)
  29. SDS (BBI)
  30. 100x Denhardt’s Solution (Invitrogen)
  31. 鲑精DNA (Sigma)
  32. 8 M尿素上样缓冲液 (见溶液配方)
  33. 5x TBE缓冲液 (见溶液配方)
  34. 预杂交液/杂交液 (见溶液配方)
  35. 非严谨洗膜液 (见溶液配方)
  36. 严谨洗膜液配方 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 量筒
  2. 电泳槽
  3. 梳子
  4. 电泳仪
  5. 转膜槽
  6. 移液器
  7. 搅拌子
  8. 暗夹
  9. BioRad Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System (BioRad, catalog number: 164-8003)
  10. 真空干燥箱 (SHEL LAB)
  11. 杂交炉 (UVP, model: HB-1000 Hybridizer)
  12. 紫外线交联仪 (UVP, model: CL-1000 Ultraviolet Crosslinker)
  13. 超声波仪 (BioruptorTM, model: UCD-200)
  14. 磷屏扫描仪 (FUJIFILM, model: FLA-5100)
  15. 离心机
  16. -20 °C冰箱

实验步骤

一、 低分子量RNA分离

  1. 100-500 μg总RNA加入等体积1.5 M氯化钠溶液和15% PEG8000,置于冰上30-60 min。
  2. 4 °C,16,000 x g离心20 min,吸上清,加入2.5倍体积预冷无水乙醇。-20 °C沉淀过夜。
  3. 4 °C,16,000 x g离心20 min,弃上清,用75%乙醇清洗沉淀。干燥,加入适量DEPC水溶解。

二、 PAGE-northern

  1. 把电泳槽,玻璃板,梳子,转膜槽清洗干净,并且浸泡在DEPC水 (未经灭菌的) 中过夜。
  2. 按Mini-PROTEAN系统操作手册固定制胶用的玻璃板,准备15%变性PAGE胶。
    5x TBE
    2 ml
    30% PAGE
    5 ml
    尿素
    4.8 g
    ddH2O
    3 ml
    待尿素溶解后,加入100 μl 10% AP和10 μl TEMED,混合均匀,灌胶。插上梳子,室温凝固45-60 min。
  3. 待胶凝固后,组装电泳槽,加入1x TBE,100 V预电泳40-60 min,用移液器将胶孔吹洗干净。
  4. 将30 μg总RNA稀释到15 μl DEPC水中,加入5 μl 8 M尿素上样缓冲液,80 °C变性10 min,立即置于冰上3 min。
  5. 短暂离心后用20 μl移液器点样,30 V电泳90 min,然后调电压至60 V,电泳至溴酚蓝跑到胶的底部。
  6. 将跑好的凝胶于EB中浸泡5 min,用DEPC水漂洗后,于凝胶成像系统中观察RNA质量。
  7. 将转膜用的海绵,滤纸,尼龙膜,PAGE胶于1x TBE润湿清洗。然后按照海绵-滤纸-PAGE胶-尼龙膜-滤纸-海绵的顺序,在转膜夹中将转膜三明治叠好,夹紧。将夹好的三明治放入转膜槽,加入冰槽,放入搅拌子,注入1x TBE缓冲液至浸没转膜三明治。将转膜槽置于搅拌器上搅拌,20 V转膜120 min。
  8. 拆除转膜装置,将尼龙膜RNA承载面朝上,在紫外线交联仪中1800 J交联两次,80 °C烘膜4 h。
  9. 将烘干的尼龙膜放入杂交管,加入60 °C预热的杂交液20 ml,并且加入100 μl 10 mg/ml超声波打断后的鲑精DNA(ssDNA),于45-50 °C预杂交8 h。
  10. 按照下面的体系标记探针
    Probe
    2 μl
    10x T4 PNK buffer
    2 μl
    T4 PNK
    1 μl
    γ-32P-ATP
    3 μl
    ddH2O
    12 μl
    37 °C 孵育60 min后,加入500 μl杂交液,80 °C变性10 min。
  11. 将步骤10中的变性探针全部加入杂交管中,杂交过夜。
  12. 倒掉杂交液,用25 ml非严谨洗膜液洗两次,每次5 min,然后用严谨洗膜液洗两次,每次10 min。将膜放于滤纸上稍晾干,用保鲜膜包好,放于暗夹中曝光24 h。
  13. 扫描磷屏。

结果与分析

  1. 所有和RNA直接接触的器具,都需要用DEPC水处理。以防RNase污染。
  2. 操作过程中,勤换手套,以防污染。
  3. 每次扫完磷屏后一定要消磁。

溶液配方

  1. 8 M尿素上样缓冲液
    0.1%溴酚蓝
    0.1%二甲苯青
    1 mM EDTA
    8 M尿素
  2. 5x TBE缓冲液配方
    450 mmol/L Tris-硼酸
    10 mmol/L EDTA
  3. 预杂交液/杂交液配方
    5x SSC
    20 mM Na2HPO4 (pH 7.2)
    7% SDS
    2x Denhardt’s Solution
  4. 非严谨洗膜液配方
    3x SSC
    25 mM NaH2PO4 (pH 7.5)
    5% SDS
    10x Denhardt’s Solution
  5. 严谨洗膜液配方
    1x SSC
    1% SDS
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:沈建强, 龙湍, 熊立仲. (2018). Small RNA分离及PAGE-northern. Bio-101: e1010117. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010117.
How to cite: Shen, J. Q., Long, T. and Xiong, L. Z. (2018). Small RNA Isolation and Detection with PAGE-northern. Bio-101: e1010117. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010117.
Q&A

Please login to post your questions/comments. Your questions will be directed to the authors of the protocol. The authors will be requested to answer your questions at their earliest convenience. Once your questions are answered, you will be informed using the email address that you register with bio-protocol.
You are highly recommended to post your data including images for the troubleshooting.

You are highly recommended to post your data (images or even videos) for the troubleshooting. For uploading videos, you may need a Google account because Bio-protocol uses YouTube to host videos.