Small RNA Isolation and Detection with PAGE-northern   

材料与试剂

1. 玻璃板
   
2. 各种规格RNase free枪头
   
3. 海绵
   
4. 滤纸
   
5. 保鲜膜
   
6. 冰槽
   
7. 丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=29:1 (BioRad, catalog number: 161-0156)
   
8. N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED) (BioRad, catalog number: 161-0800)
   
9. 10%过硫酸铵(AP) (Sigma, catalog number: A7460)
   
10. 尿素 (Sigma, catalog number: U6504)
    
11. 0.1%溴酚蓝
    
12. 0.1%二甲苯青
    
13. 8 M尿素
    
14. 尼龙膜 (Amershan, catalog number: RPN3038)
    
15. T4寡核苷酸激酶 (Takara)
    
16. γ-³²P-ATP (PerkinElmer, catalog number: BLU002Z250UC)
    
17. Tris (Sigma)
    
18. 硼酸 (Sigma)
    
19. EDTA (FLUKA)
    
20. DEPC (Sigma, catalog number: D5758)
    
21. 无水乙醇和75%乙醇
    
22. 0.01% DEPC水
    
23. EB
    
24. 氯化钠 (Sigma)
    
25. 柠檬酸钠 (Sigma)
    
26. 磷酸二氢钠 (Sigma)
    
27. 磷酸氢二钠 (Sigma)
    
28. PEG8000 (Sigma)
    
29. SDS (BBI)
    
30. 100x Denhardt’s Solution (Invitrogen)
    
31. 鲑精DNA (Sigma)
    
32. 8 M尿素上样缓冲液 (见溶液配方)
    
33. 5x TBE缓冲液 (见溶液配方)
    
34. 预杂交液/杂交液 (见溶液配方)
    
35. 非严谨洗膜液 (见溶液配方)
    
36. 严谨洗膜液配方 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 量筒
   
2. 电泳槽
   
3. 梳子
   
4. 电泳仪
   
5. 转膜槽
   
6. 移液器
   
7. 搅拌子
   
8. 暗夹
   
9. BioRad Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System (BioRad, catalog number: 164-8003)
   
10. 真空干燥箱 (SHEL LAB)
    
11. 杂交炉 (UVP, model: HB-1000 Hybridizer)
    
12. 紫外线交联仪 (UVP, model: CL-1000 Ultraviolet Crosslinker)
    
13. 超声波仪 (Bioruptor^TM, model: UCD-200)
    
14. 磷屏扫描仪 (FUJIFILM, model: FLA-5100)
    
15. 离心机
    
16. -20 °C冰箱
    

实验步骤

一、低分子量RNA分离

1. 100-500 μg总RNA加入等体积1.5 M氯化钠溶液和15% PEG8000，置于冰上30-60 min。
   
2. 4 °C，16,000 x g离心20 min，吸上清，加入2.5倍体积预冷无水乙醇。-20 °C沉淀过夜。
   
3. 4 °C，16,000 x g离心20 min，弃上清，用75%乙醇清洗沉淀。干燥，加入适量DEPC水溶解。
   
   

二、PAGE-northern

1. 把电泳槽，玻璃板，梳子，转膜槽清洗干净，并且浸泡在DEPC水 (未经灭菌的) 中过夜。
   
2. 按Mini-PROTEAN系统操作手册固定制胶用的玻璃板，准备15%变性PAGE胶。
   

   5x TBE	2 ml
   30% PAGE	5 ml
   尿素	4.8 g
   ddH2O	3 ml

   待尿素溶解后，加入100 μl 10% AP和10 μl TEMED，混合均匀，灌胶。插上梳子，室温凝固45-60 min。
   
3. 待胶凝固后，组装电泳槽，加入1x TBE，100 V预电泳40-60 min，用移液器将胶孔吹洗干净。
   
4. 将30 μg总RNA稀释到15 μl DEPC水中，加入5 μl 8 M尿素上样缓冲液，80 °C变性10 min，立即置于冰上3 min。
   
5. 短暂离心后用20 μl移液器点样，30 V电泳90 min，然后调电压至60 V，电泳至溴酚蓝跑到胶的底部。
   
6. 将跑好的凝胶于EB中浸泡5 min，用DEPC水漂洗后，于凝胶成像系统中观察RNA质量。
   
7. 将转膜用的海绵，滤纸，尼龙膜，PAGE胶于1x TBE润湿清洗。然后按照海绵-滤纸-PAGE胶-尼龙膜-滤纸-海绵的顺序，在转膜夹中将转膜三明治叠好，夹紧。将夹好的三明治放入转膜槽，加入冰槽，放入搅拌子，注入1x TBE缓冲液至浸没转膜三明治。将转膜槽置于搅拌器上搅拌，20 V转膜120 min。
   
8. 拆除转膜装置，将尼龙膜RNA承载面朝上，在紫外线交联仪中1800 J交联两次，80 °C烘膜4 h。
   
9. 将烘干的尼龙膜放入杂交管，加入60 °C预热的杂交液20 ml，并且加入100 μl 10 mg/ml超声波打断后的鲑精DNA(ssDNA)，于45-50 °C预杂交8 h。
   
10. 按照下面的体系标记探针
    

    Probe	2 μl
    10x T4 PNK buffer	2 μl
    T4 PNK	1 μl
    γ-32P-ATP	3 μl
    ddH2O	12 μl

    37 °C 孵育60 min后，加入500 μl杂交液，80 °C变性10 min。
    
11. 将步骤10中的变性探针全部加入杂交管中，杂交过夜。
    
12. 倒掉杂交液，用25 ml非严谨洗膜液洗两次，每次5 min，然后用严谨洗膜液洗两次，每次10 min。将膜放于滤纸上稍晾干，用保鲜膜包好，放于暗夹中曝光24 h。
    
13. 扫描磷屏。
    

结果与分析

1. 所有和RNA直接接触的器具，都需要用DEPC水处理。以防RNase污染。
   
2. 操作过程中，勤换手套，以防污染。
   
3. 每次扫完磷屏后一定要消磁。
   

溶液配方

1. 8 M尿素上样缓冲液
   0.1%溴酚蓝
   0.1%二甲苯青
   1 mM EDTA
   8 M尿素
   
2. 5x TBE缓冲液配方
   450 mmol/L Tris-硼酸
   10 mmol/L EDTA
   
3. 预杂交液/杂交液配方
   5x SSC
   20 mM Na₂HPO₄ (pH 7.2)
   7% SDS
   2x Denhardt’s Solution
   
4. 非严谨洗膜液配方
   3x SSC
   25 mM NaH₂PO₄ (pH 7.5)
   5% SDS
   10x Denhardt’s Solution
   
5. 严谨洗膜液配方
   1x SSC
   1% SDS