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水稻组织mRNA分离   

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实验原理:真核细胞mRNA最显著特征是具有5’–端帽子结构和3'–端的polyA尾巴。mRNA的polyA与oligo(dT)纤维素柱在高盐下亲和吸附。在低盐下吸附解除,因此可利用该原理分离mRNA,再用有机溶剂沉淀可得纯化mRNA。
实验目的:从水稻组织中分离纯化mRNA,可以用于逆转录,RACE和文库构建等后续实验。

关键词: 水稻, mRNA, 分离

材料与试剂

  1. 枪头及配套枪头盒:1 ml、200 μl、20 μl (AXYGEN)
  2. 离心管和配套管架:1.5 ml (AXYGEN)
  3. 50 ml离心管:分装氯仿、异丙醇和酒精
  4. 液氮 (湖北省畜牧局制氧厂)
  5. 焦碳酸二乙酯 (DEPC, Sigma, catalog number: D5758)
  6. 苯酚:氯仿:异戊醇 (体积比25:24:1) 或氯仿 (国药试剂,分析纯)
  7. 异丙醇 (国药试剂,分析纯)
  8. 无水乙醇或95%乙醇 (国药试剂,分析纯)
  9. 75%乙醇 (用95%乙醇和0.1‰ DEPC处理过的H2O配制)
  10. TE缓冲液
  11. Tris-HCl
  12. 糖原 (Glycogen)
  13. NaAc
  14. Micro-FastTrackTM 2.0 Kit (Invitrogen, catalog number: K1520-02)
  15. 0.1‰ DEPC处理水 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 研钵和研磨棒
  2. 移液器:1 ml、200 μl、20 μl、10 μl、2.5 μl (Eppendorf)
  3. 试剂瓶:250 ml
  4. 4 °C冷冻离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge 5417R)
  5. 紫外分光光度计:Nanodrop (Thermo Fisher)
  6. -80 °C冰箱
  7. 灭菌锅
  8. 计时器
  9. 平板摇床或混悬仪

实验步骤

  1. 液氮取样,按照“水稻组织总RNA抽提”抽提总RNA (25:24:1或氯仿抽提2次) (方玉洁等,2018)。
  2. 从总RNA中分离mRNA (每份总RNA > 600 μg)
    2.1
    乙醇沉淀总RNA并用80%乙醇浸洗沉淀。
    注:乙醇沉淀总RNA时,-80 °C冰箱过夜效果较好。
    2.2
    用10 μl Elution Buffer重悬沉淀。
    2.3
    在灭菌离心管中将RNA溶液加入到1 ml Micro-FastTrackTM 2.0 Binding Buffer中。
    2.4
    65 °C干浴5 min后立即置于冰上1 min (精确计时)。
    2.5
    将总RNA溶液加入到1份oligo(dT)纤维素中,记录样品名。
    2.6
    oligo(dT)纤维素吸胀2 min。
    2.7
    室温轻柔摇晃离心管45 min (平板摇床,rotator或手摇均可)
    2.8
    4,000 x g离心5 min,弃上清,切忌扰动oligo(dT)纤维素沉淀。
  3. 清洗oligo(dT)纤维素
    3.1
    用1.3 ml Binding Buffer重悬oligo(dT)纤维素,室温(25 °C) 4,000 x g离心5 min,弃上清。
    3.2
    重复上一步骤3.1至少3次直至buffer不再浑浊。
    3.3
    用0.3 ml Binding Buffer轻柔重悬树脂,并将样品转到spin-column中,室温4,000 x g离心10 sec,重复此步骤直至将所有oligo(dT) cellulose全部转到spin-column中。
    3.4
    将spin-column取出,弃去离心管中的液体。
    3.5
    将spin-column放回管中,加入500 μl Binding Buffer,室温4,000 x g离心10 sec (Optional:测清洗液的OD260)。
    3.6
    重复步骤3.5至少3次直到flow-through的OD260 < 0.05。
    3.7
    向树脂中加入200 μl (可适当多加,可加400 μl) Low Salt Wash Buffer重悬树脂。
    注:切忌损伤spin-column的膜!室温4,000 x g离心10 sec。
    3.8
    重复步骤3.7。
  4. 洗脱和沉淀mRNA
    4.1
    将spin-column放入一个新离心管中。
    4.2
    用灭菌的RNA枪头加入100 μl Elution Buffer。
    4.3
    室温4,000 x g离心10 sec,此时mRNA即在洗脱液中。
    4.4
    再向column中加入100 μl Elution Buffer,再次离心10 sec。
    4.5
    弃column,此时离心管中得到200 μl mRNA样品。
    4.6
    用10 μl糖原,30 μl NaAc和60 μl无水乙醇沉淀mRNA,充分混匀后于-80 °C沉淀 (沉淀过夜效果较好)。
    4.7
    将离心管中的样品解冻,4 °C 16,000 x g (最大转速) 冷冻离心15 min。
    4.8
    小心弃上清,短暂离心,小心用RNA枪头吸弃残余乙醇,用1-10 μl Elution Buffer (10 mM pH 7.5的Tris-HCl) 重悬mRNA沉淀,立即用于cDNA合成或保存于-80 °C冰箱 (或保存在70%乙醇中并贮存于-80 °C)。

注意事项

  1. 整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则。
  2. 提取的总RNA必须完整,不能被降解,这是mRNA质量好的先决条件。
  3. 总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当,过量的总RNA,容易造成mRNA纯度降低。
  4. RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65 °C加热5 min,这一步很重要,其作用是:(1) 破坏mRNA的二级结构,特别是poly(A)尾巴处的二级结构,使poly(A)尾巴充分暴露,提高poly(A)RNA回收率;(2) 解离mRNA与rRNA的结合。加热后应立即插入冰上,以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。
  5. 应注意mRNA分离时,防止DNA污染,微量DNA污染,将影响实验结果。
  6. 为防止mRNA降解,应避免多次冻融,可将mRNA少量分装后保存于-80 °C冰箱。此外,-70 °C条件下mRNA在70%乙醇中可保存一年以上。
  7. 分离得到的mRNA,要求A260:A280不小于2.0。

溶液配方

  1. 0.1‰ DEPC处理水
    将DEPC按照1:10,000(体积比)加入双蒸水,搅拌8 h以上,根据需要可高温高压灭菌。

参考文献

  1. 方玉洁等. (2018). 水稻组织总RNA抽提方法. Bio-101 e1010111. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010111. (in press)
  2. Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162(1): 156-159.
  3. Chomczynski, P. (1993). A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques 15(3): 532-534, 536-537.
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:方玉洁, 沈建强, 熊立仲. (2018). 水稻组织mRNA分离. Bio-101: e1010112. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010112.
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