水稻组织mRNA分离   

材料与试剂

1. 枪头及配套枪头盒：1 ml、200 μl、20 μl (AXYGEN)
2. 离心管和配套管架：1.5 ml (AXYGEN)
3. 50 ml离心管：分装氯仿、异丙醇和酒精
4. 液氮 (湖北省畜牧局制氧厂)
5. 焦碳酸二乙酯 (DEPC, Sigma, catalog number: D5758)
6. 苯酚:氯仿:异戊醇 (体积比25:24:1) 或氯仿 (国药试剂，分析纯)
7. 异丙醇 (国药试剂，分析纯)
8. 无水乙醇或95%乙醇 (国药试剂，分析纯)
9. 75%乙醇 (用95%乙醇和0.1‰ DEPC处理过的H₂O配制)
10. TE缓冲液
11. Tris-HCl
12. 糖原 (Glycogen)
13. NaAc
14. Micro-FastTrack^TM 2.0 Kit (Invitrogen, catalog number: K1520-02)
15. 0.1‰ DEPC处理水 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 研钵和研磨棒
   
2. 移液器：1 ml、200 μl、20 μl、10 μl、2.5 μl (Eppendorf)
   
3. 试剂瓶：250 ml
   
4. 4 °C冷冻离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge 5417R)
   
5. 紫外分光光度计：Nanodrop (Thermo Fisher)
   
6. -80 °C冰箱
   
7. 灭菌锅
   
8. 计时器
   
9. 平板摇床或混悬仪
   

实验步骤

1. 液氮取样，按照“水稻组织总RNA抽提”抽提总RNA (25:24:1或氯仿抽提2次) (方玉洁等，2018)。
   
2. 从总RNA中分离mRNA (每份总RNA > 600 μg)
   2.1

   乙醇沉淀总RNA并用80%乙醇浸洗沉淀。
   注：乙醇沉淀总RNA时，-80 °C冰箱过夜效果较好。
   
   2.2

   用10 μl Elution Buffer重悬沉淀。
   
   2.3

   在灭菌离心管中将RNA溶液加入到1 ml Micro-FastTrack^TM 2.0 Binding Buffer中。
   
   2.4

   65 °C干浴5 min后立即置于冰上1 min (精确计时)。
   
   2.5

   将总RNA溶液加入到1份oligo(dT)纤维素中，记录样品名。
   
   2.6

   oligo(dT)纤维素吸胀2 min。
   
   2.7

   室温轻柔摇晃离心管45 min (平板摇床，rotator或手摇均可)
   
   2.8

   4,000 x g离心5 min，弃上清，切忌扰动oligo(dT)纤维素沉淀。
3. 清洗oligo(dT)纤维素
   3.1

   用1.3 ml Binding Buffer重悬oligo(dT)纤维素，室温(25 °C) 4,000 x g离心5 min，弃上清。
   
   3.2

   重复上一步骤3.1至少3次直至buffer不再浑浊。
   
   3.3

   用0.3 ml Binding Buffer轻柔重悬树脂，并将样品转到spin-column中，室温4,000 x g离心10 sec，重复此步骤直至将所有oligo(dT) cellulose全部转到spin-column中。
   
   3.4

   将spin-column取出，弃去离心管中的液体。
   
   3.5

   将spin-column放回管中，加入500 μl Binding Buffer，室温4,000 x g离心10 sec (Optional：测清洗液的OD₂₆₀)。
   
   3.6

   重复步骤3.5至少3次直到flow-through的OD₂₆₀ < 0.05。
   
   3.7

   向树脂中加入200 μl (可适当多加，可加400 μl) Low Salt Wash Buffer重悬树脂。
   注：切忌损伤spin-column的膜！室温4,000 x g离心10 sec。
   
   3.8

   重复步骤3.7。
4. 洗脱和沉淀mRNA
   4.1

   将spin-column放入一个新离心管中。
   
   4.2

   用灭菌的RNA枪头加入100 μl Elution Buffer。
   
   4.3

   室温4,000 x g离心10 sec，此时mRNA即在洗脱液中。
   
   4.4

   再向column中加入100 μl Elution Buffer，再次离心10 sec。
   
   4.5

   弃column，此时离心管中得到200 μl mRNA样品。
   
   4.6

   用10 μl糖原，30 μl NaAc和60 μl无水乙醇沉淀mRNA，充分混匀后于-80 °C沉淀 (沉淀过夜效果较好)。
   
   4.7

   将离心管中的样品解冻，4 °C 16,000 x g (最大转速) 冷冻离心15 min。
   
   4.8

   小心弃上清，短暂离心，小心用RNA枪头吸弃残余乙醇，用1-10 μl Elution Buffer (10 mM pH 7.5的Tris-HCl) 重悬mRNA沉淀，立即用于cDNA合成或保存于-80 °C冰箱 (或保存在70%乙醇中并贮存于-80 °C)。
   

注意事项

1. 整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则。
   
2. 提取的总RNA必须完整，不能被降解，这是mRNA质量好的先决条件。
   
3. 总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当，过量的总RNA，容易造成mRNA纯度降低。
   
4. RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65 °C加热5 min，这一步很重要，其作用是：(1) 破坏mRNA的二级结构，特别是poly(A)尾巴处的二级结构，使poly(A)尾巴充分暴露，提高poly(A)RNA回收率；(2) 解离mRNA与rRNA的结合。加热后应立即插入冰上，以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。
   
5. 应注意mRNA分离时，防止DNA污染，微量DNA污染，将影响实验结果。
   
6. 为防止mRNA降解，应避免多次冻融，可将mRNA少量分装后保存于-80 °C冰箱。此外，-70 °C条件下mRNA在70%乙醇中可保存一年以上。
   
7. 分离得到的mRNA，要求A₂₆₀:A₂₈₀不小于2.0。
   

溶液配方

1. 0.1‰ DEPC处理水
   将DEPC按照1:10,000（体积比）加入双蒸水，搅拌8 h以上，根据需要可高温高压灭菌。
   

参考文献

1. 方玉洁等. (2018). 水稻组织总RNA抽提方法. Bio-101 e1010111. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010111. (in press)
   
2. Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162(1): 156-159.
   
3. Chomczynski, P. (1993). A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques 15(3): 532-534, 536-537.