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水稻种子高质量DNA抽提   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:水稻种子含有较少量的基因组DNA,为了尽可能多而完整地将其抽提出来,需要加入去污剂SDS裂解细胞,Proteinase K降解蛋白,再用CTAB进行抽提。
实验目的:高质量地抽提水稻种子胚乳中的基因组DNA,可用于基因型鉴定,余下含胚的部分可进行后续发芽实验。若不需要发芽,可抽提整粒种子。

关键词: 水稻, 种子, DNA

材料与试剂

  1. 2 ml离心管
  2. 刀片 (切种子)
  3. 各种型号枪头 (20 μl,200 μl,1 ml)
  4. 水稻种子
  5. 液氮
  6. CTAB (BBI, catalog number: CB0108)
  7. Tris (BBI, catalog number: TB0194)
  8. HCl (36-38%,分析纯)
  9. SDS (BBI, catalog number: SB0485)
  10. NaCl (BBI, catalog number: SB0476)
  11. EDTA (Sangon, catalog number: E0105)
  12. PVP (polyvinylpyrrolidone), Mr40,000
  13. Proteinase K (Takara, catalog number: D9033)
  14. NaOH (Sigma, catalog number: S8045)
  15. Chloroform (国产,分析纯)
  16. Isoamyl alcohol (国产,分析纯)
  17. Phenol (Sangon, catalog number: PD0419-3)
  18. 95% Ethanol (国产,分析纯)
  19. RNase酶
  20. Extraction buffer (见溶液配方)
  21. 2x CTAB solution (见溶液配方)
  22. 1 M Tris-HCl (pH 8.0) (见溶液配方)
    23. 0.5 M EDTA (pH 8.0) (见溶液配方)

仪器设备

  1. 研钵
  2. 移液枪
  3. 恒温水浴锅
  4. 冷冻离心机 (Backman)

实验步骤

将种子去壳 (如果该种子还要用于发芽,用刀将其从中间切开,分为含胚和不含胚的两部分,含胚的部分用于后续发芽实验,不含胚的部分) 置2 ml离心管中待抽提DNA。

  1. 在2 ml离心管中加入400 μl Extraction buffer (含Proteinase K 50 μg),37 °C孵育1 h。
  2. 用研钵研磨。
  3. 加入400 μl (等体积) 2x CTAB solution。
  4. 加入等体积的酚仿 (氯仿:异戊醇24:1, 5%苯酚),轻柔摇15 min。
  5. 12,000 rpm,4 °C离心10 min,吸取上清至新的1.5 ml离心管。
  6. 加入2/3体积的异丙醇,室温沉淀10 min (或用2倍体积无水乙醇 -20 °C沉淀1 h以上)。
  7. 12,000 rpm离心10 min,去上清。
  8. 70%乙醇,12,000 rpm离心5 min,去上清。
  9. 吹干后,用含1 μl RNase (10 mg/ml) 的50 μl ddH2O (或TE) 溶解。

结果与分析

得到的DNA可以跑琼脂糖胶检测质量。通常可以得到接近于叶片质量的基因组DNA,可用于PCR检测基因型,或Southern blot (需要≥5粒种子以获得足够的DNA)。

注意事项

Proteinase K和PVP的添加在实验中不可省略,否则有时可能不能抽提到理想质量的基因组DNA。

溶液配方

  1. Extraction buffer

  2. 2x CTAB solution

  3. 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 50 ml
    用ddH2O 40 ml溶解Tris 6.057 g,浓HCl调pH至8.0,定容到50 ml。
  4. 0.5 M EDTA (pH 8.0) 10 ml
    称取1.8612 g EDTA,加8 ml ddH2O,用固体NaOH调pH至8.0,定容到10 ml。

参考文献

  1. Kang, H. W., Cho, Y. G., Yoon, U. H. and Eun, M. Y. (1998). A rapid DNA extraction method for RFLP and PCR analysis from a single dry seed. Plant Mol Biol Rep 16: 1-9.
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:刘菊红, 徐艳, 熊立仲. (2018). 水稻种子高质量DNA抽提. Bio-101: e1010103. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010103.
How to cite: Liu, J. H., Xu, Y. and Xiong, L. Z.  (2018). High-quality DNA Extraction from Rice Seeds. Bio-101: e1010103. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010103.
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