实验原理:水稻种子含有较少量的基因组DNA,为了尽可能多而完整地将其抽提出来,需要加入去污剂SDS裂解细胞,Proteinase K降解蛋白,再用CTAB进行抽提。
实验目的:高质量地抽提水稻种子胚乳中的基因组DNA,可用于基因型鉴定,余下含胚的部分可进行后续发芽实验。若不需要发芽,可抽提整粒种子。
关键词: 水稻, 种子, DNA
材料与试剂
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2 ml离心管
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刀片 (切种子)
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各种型号枪头 (20 μl,200 μl,1 ml)
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水稻种子
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液氮
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CTAB (BBI, catalog number: CB0108)
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Tris (BBI, catalog number: TB0194)
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HCl (36-38%,分析纯)
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SDS (BBI, catalog number: SB0485)
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NaCl (BBI, catalog number: SB0476)
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EDTA (Sangon, catalog number: E0105)
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PVP (polyvinylpyrrolidone), Mr40,000
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Proteinase K (Takara, catalog number: D9033)
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NaOH (Sigma, catalog number: S8045)
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Chloroform (国产,分析纯)
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Isoamyl alcohol (国产,分析纯)
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Phenol (Sangon, catalog number: PD0419-3)
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95% Ethanol (国产,分析纯)
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RNase酶
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Extraction buffer (见溶液配方)
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2x CTAB solution (见溶液配方)
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1 M Tris-HCl (pH 8.0) (见溶液配方)
23. 0.5 M EDTA (pH 8.0) (见溶液配方)
仪器设备
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研钵
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移液枪
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恒温水浴锅
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冷冻离心机 (Backman)
实验步骤
将种子去壳 (如果该种子还要用于发芽,用刀将其从中间切开,分为含胚和不含胚的两部分,含胚的部分用于后续发芽实验,不含胚的部分) 置2 ml离心管中待抽提DNA。
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在2 ml离心管中加入400 μl Extraction buffer (含Proteinase K 50 μg),37 °C孵育1 h。
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用研钵研磨。
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加入400 μl (等体积) 2x CTAB solution。
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加入等体积的酚仿 (氯仿:异戊醇24:1, 5%苯酚),轻柔摇15 min。
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12,000 rpm,4 °C离心10 min,吸取上清至新的1.5 ml离心管。
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加入2/3体积的异丙醇,室温沉淀10 min (或用2倍体积无水乙醇 -20 °C沉淀1 h以上)。
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12,000 rpm离心10 min,去上清。
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70%乙醇,12,000 rpm离心5 min,去上清。
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吹干后,用含1 μl RNase (10 mg/ml) 的50 μl ddH2O (或TE) 溶解。
结果与分析
得到的DNA可以跑琼脂糖胶检测质量。通常可以得到接近于叶片质量的基因组DNA,可用于PCR检测基因型,或Southern blot (需要≥5粒种子以获得足够的DNA)。
注意事项
Proteinase K和PVP的添加在实验中不可省略,否则有时可能不能抽提到理想质量的基因组DNA。
溶液配方
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Extraction buffer

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2x CTAB solution

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1 M Tris-HCl (pH 8.0) 50 ml
用ddH2O 40 ml溶解Tris 6.057 g,浓HCl调pH至8.0,定容到50 ml。
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0.5 M EDTA (pH 8.0) 10 ml
称取1.8612 g EDTA,加8 ml ddH2O,用固体NaOH调pH至8.0,定容到10 ml。
参考文献
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Kang, H. W., Cho, Y. G., Yoon, U. H. and Eun, M. Y. (1998). A rapid DNA extraction method for RFLP and PCR analysis from a single dry seed. Plant Mol Biol Rep 16: 1-9.
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