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水稻叶片高质量DNA抽提   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:植物体内的DNA通常在细胞核中以核蛋白的形式存在,利用阳离子去垢剂CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵) 与剧烈的高低温差破坏细胞膜结构使这些核蛋白释放出来。利用氯仿等有机试剂去除蛋白、多糖、酚类等杂质,且DNA在高盐 (1 M NaCl溶液) 条件下可溶,最后使用高浓度酒精溶液重新沉淀获得高质量的植物基因组DNA。
实验目的:大量提取植物基因组DNA,可用于Southern blot分析,对转基因植株进行外源基因插入拷贝数和整合模式检测等。

关键词: 总DNA, 大样抽提, Southern blot

材料与试剂

  1. 10 ml离心管
  2. 水稻叶片
  3. CTAB粉末 (Bio Basic Inc. GB0308BJ011J)
  4. Tris-HCl, pH 8.0 (进口分装)
  5. EDTA, pH 8.0 (国药)
  6. NaCl (国药集团有限公司,分析纯)
  7. 异戊醇
  8. 液氮
  9. 氯仿/异戊醇 (24:1)
  10. 10% CTAB
  11. RNase
  12. 75%乙醇
  13. 琼脂糖
  14. 1.5х CTAB (见溶液配方)
  15. 10% CTAB (见溶液配方)
  16. 1% CTAB (见溶液配方)
  17. 氯仿/异戊醇24:1 (体积比) (见溶液配方)
  18. 1 M NaCl溶液 (见溶液配方)
  19. TE buffer (见溶液配方)

仪器设备

  1. 水浴锅
  2. 通风橱
  3. 离心机

实验步骤

  1. 取1 g生长旺盛的水稻植株叶片,于液氮中迅速研磨成粉。
    注意:请用冰盒取样,如不能立即抽提可保存于-20 °C。建议取样后尽快抽提,避免样品DNA降解。将粉末转移至10 ml离心管中,加入2 ml (枪头需提前划好刻度以免因受热后吸取过量)煮沸的1.5х CTAB (保持高温)。
  2. 65 °C温浴30 min。
  3. 检查样品顺序,在通风橱内加入等体积 (氯仿腐蚀性很强且易挥发,对移液器损害很大,可使用玻璃滴管) 的氯仿/异戊醇 (V/V=24:1),盖紧管盖,仔细检查保证每个离心管不漏液,轻缓颠倒混匀25 min,3,000 rpm离心15 min。
  4. 打开管盖,转移上清液于另一10 ml离心管中,加入1/10体积 (约200μl) 的10% CTAB (提前于65 °C温浴),再加入等体积的氯仿/异戊醇(V/V=24:1),轻缓颠倒混匀20 min,3,000 rpm离心15 min。
  5. 用移液器吸上清 (如果使用1 ml的枪头,需提前剪去大约7 mm的枪尖,吸取上清时会更加平缓) 转移到于离心管,加入5 ml 1% CTAB,充分混合均匀后,静置10 min看见离心管中絮状DNA聚集,3,000 rpm离心15 min。
  6. 弃上清,每管加入1 ml 1 M NaCl溶液和1 µl 100 µg/ml RNase (可根据所需量提前配好Mixture),65 °C溶解1 d。
  7. 加入3 ml -20 °C预冷的无水乙醇 (95%乙醇也可),充分混合均匀后可见絮状DNA沉淀。
  8. 用枪头将DNA沉淀转至新的1.5 ml离心管中,用75%的乙醇洗涤沉淀,10,000 rpm离心5 min。
  9. 弃上清,晾干后溶于50 µl-100 µl TE中,溶解至少1周。
    注:如果需要较长时间保存DNA用TE溶解;如果仅较短时间保存DNA可直接用灭菌双蒸水溶解。
  10. 取1 µl DNA溶液用于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA质量,剩余DNA于-20 °C保存备用。

溶液配方

  1. 1.5х CTAB
    15 g
    CTAB粉末 (Bio Basic Inc. GB0308BJ011J)
    75 ml
    1 M Tris-HCl, pH 8.0 (进口分装)
    30 ml
    0.5 M EDTA, pH 8.0 (国药)
    61.4 g
    NaCl (国药集团有限公司,分析纯)
    定容1 L,搅拌溶解2 h
  2. 10% CTAB
    100 g
    CTAB粉末
    40.95 g
    NaCl
    定容1 L,搅拌溶解过夜,使用前65 °C水浴预热
  3. 1% CTAB
    10 g
    CTAB粉末
    50 ml
    1 M Tris-HCl, pH 8.0
    20 ml
    0.5 M EDTA, pH 8.0
    定容1 L,搅拌均匀
  4. 氯仿/异戊醇24:1 (体积比)
    在500 ml氯仿中加入22 ml异戊醇
  5. 1 M NaCl溶液
    NaCl 58.44 g,加双蒸水溶解,定容1 L,分装后灭菌
  6. TE buffer
    5 ml
    1 M Tris-HCl, pH 8.0
    1 ml
    0.5 M EDTA, pH 8.0
    加双蒸水溶解,定容500 ml,分装后灭菌
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:吴昊, 陈太钰, 林拥军, 陈浩. (2018). 水稻叶片高质量DNA抽提. Bio-101: e1010102. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010102.
How to cite: Wu, H., Chen, T. Y., Lin, Y. J. and Chen, H.  (2018). High-quality DNA Extraction from Rice Leaves. Bio-101: e1010102. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010102.
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