黄翅大白蚁肠道放线菌的分离与培养

研究背景

黄翅大白蚁作为一种培菌白蚁，与特定真菌-鸡枞菌 (Termitomyces) 共生，在白蚁巢内建立菌圃，培养小白球菌 (Termitosphaeria duthiei (Berk.) Ciferri.) 为白蚁提供营养 (Hager et al., 2013；Ramadhar et al., 2014)。培菌白蚁主要分布在非洲和亚洲热带地区，在植物废弃物的降解过程中发挥重要作用 (Aanen et al., 2005)。培菌白蚁自身和菌圃真菌 (鸡枞菌) 易受多种真菌侵染，但在健康的白蚁蚁巢中只有鸡枞菌生长，白蚁或其共生菌必然存在一定的机制来抵制致病菌，其中放线菌作为次级代谢产物主要产生者，可能起着关键的作用 (徐晓 等，2018)。培菌昆虫相关放线菌是天然产物的广泛来源，结构多样的次级代谢物包括多肽、大环内酯、多烯、醌酮和生物碱等，常参与到微生物-宿主的相互作用中 (未建华 等，2019)。昆虫肠道、体表及巢穴作为多种微生物的栖息地，蕴含着丰富的放线菌资源，本文主要介绍从培菌白蚁肠道分离放线菌的方法。

材料与试剂

1. 无菌培养皿
2. 琼脂 (生工生物工程有限公司，产品目录号: A505255)
3. 酵母粉 (Oxoid, England, 产品目录号: LP0021)
4. 胰蛋白胨 (生工生物工程有限公司，产品目录号: A505247)
5. 麸皮琼脂培养基 (索莱宝，北京，产品目录号: LA8720)
6. 无机盐 (NaCl，KCl，Na₂HPO₄，NaH₂PO₄，KNO₃，K₂HPO₄·3H₂O，MgSO₄·7H₂O，FeSO₄·7H₂O，K₂HPO₄，MgSO₄，(NH₄)₂SO₄，CaCO₃，MnCl₂·4H₂O，ZnSO₄·7H₂O皆购自国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
7. 引物合成，PCR产物测序 (北京六合华大基因科技股份有限公司)
8. 16SrRNA通用引物: 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)；1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)
9. 基因组提取试剂盒 (Bacterial DNA Kit 500，Omega bio-tek公司，D3350-01)
10. DNA纯化试剂盒 (Gel Extraction Kit 200，Omega bio-tek公司，D2500-02)
11. PBS缓冲液 (见溶液配方)
12. 高氏一号培养基 (见溶液配方)
13. 可溶性淀粉培养基 (见溶液配方)
14. 1,000×微量盐溶液 (见溶液配方)
15. 麸皮培养基 (见溶液配方)
16. LB 培养基 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 超净工作台 (品牌AIRTCH)
2. 涂布棒
3. 分析天平 (赛多利斯公司，北京，型号: ALC-110.4&1100.2)
4. 高压灭菌器 (爱博公司，山东)
5. 恒温培养箱 (精宏实验设备公司，上海，型号: DNP-9052)
6. 恒温水浴摇床 (知楚仪器公司，上海)
7. PCR仪 (品牌TaKaRa)
8. 电泳仪 (六一电泳器材厂公司，北京，型号: DYY-10C)
9. 恒温金属浴 (博日科技公司，杭州)
10. 凝胶成像仪 (品牌UVItec)
11. 离心机 (品牌Eppendorf，型号: Centrifuge 5417)
12. 移液器
    

软件和数据库

1. 利用细菌16S序列进行菌种鉴定网站https://www.ezbiocloud.net/identify; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
2. 各国菌种保藏中心网址 (可参考各种培养基的配制方法，并且每种微生物都有其对应的培养基)：
   
   2.1

   德国微生物菌种保藏中心 (DSMZ) Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, https://www.dsmz.de/.
   2.2

   日本菌种保藏中心 (JCM) Japan Collection of Microorganisms, https://jcm.brc.riken.jp/en/.
   2.3

   韩国菌种保藏中心 (KCTC) Korean collection for type cultures, https://kctc.kribb.re.kr/En/Kctc.
3. MAGE7.0 软件，下载地址MEGA7.0.26_win64_setup.exe, https://www.megasoftware.net/.
   

实验步骤

一、 白蚁肠道放线菌的分离与纯化

1. 白蚁前、中肠样品准备参照Wu文章中的方法 (Wu et al., 2012)，解剖后用研磨棒充分研磨样品5-10 min，直至肠道样品呈均质状态。
2. 取各个梯度PBS稀释液 (10-1、10-2、10-3、10-4) 150 μl分别涂布于高氏一号培养基中，30 °C培养，每天观察平板上菌落生长情况。
3. 根据菌落大小和形态，在平板上挑取典型的放线菌菌落 (菌落干燥紧致、明显产孢) 。
4. 通过稀释涂布和划线的方法，经可溶性淀粉培养基纯化至只有同一种菌落，即得到纯化的克隆。
   

二、 白蚁肠道分离菌株的序列分析

1. 将纯化的菌株接入20 ml液体麸皮培养基中，30 °C培养3 d后，离心收集菌体。
2. 利用基因组试剂盒提取菌株的基因组DNA，用分光光度计和琼脂糖电泳法检测DNA浓度和纯度。
3. 利用16S rRNA 通用引物27F 和1492R 扩增16S rRNA，PCR 体系为基因组DNA (50-200 ng/μl) 1 μl，27F 1 μl，1492R 1 μl，dNTPs 4 μl，10×Buffer 5 μl, EasyTaq 1 μl，ddH2O 37 μl。PCR 条件为预变性95 °C 5 min；95 °C 30 s，58 °C 45 s，72 °C 2 min，35个PCR循环；终延伸72 °C 10 min。
4. 将获得的PCR产物进行琼脂糖 (1%) 凝胶电泳。
5. 切胶回收1500 bp片段，用DNA纯化试剂盒纯化PCR片段，纯化片段送上海生工测序。
6. 测序结果利用NCBI Blast比对，取相似性高的序列，利用MAGE7.0 软件邻位法构建系统发育树。
   

结果与分析

       从高氏一号培养基上挑选典型的放线菌菌落，在前肠菌悬液稀释10 倍后的平板上有比较多的具有放线菌特征的菌落。放线菌在黄翅大白蚁肠道不是优势菌，因而在较低的稀释倍数时可以得到较多的放线菌，但同一平板上细菌数目也很多，经多次稀释涂布平板和平板划线后，最后得到 13 株放线菌菌株 (表1) 。其中工蚁 (Worker) 前肠 (Foregut) 来源的有11 株，为 WF-1、WF-2、WF-3、WF-4、WF-5、WF-6、WF-7、WF-8、WF-12、WF-13、WF-14，其相似性最高的菌株分别是 Kitasatospora cheerisanensis，K. cheerisanensis，Streptomyces puniceus，S. coelicoflavus，S. tacrolimicus，K. phosalacinea，S. pratensis，S. luridiscabiei，K. purpeofusca，K.purpeofusca 和 S. viridobrunneus，最大相似性为 98.14%-99.93%。从工蚁中肠 (Midgut) 得到 2株放线菌：WM-1 和 WM-3，同 S. badius、S. fumigatiscleroticus 相似性分别为 99.79%和 99.38%。

表1. 基于16S rRNA 的13 株放线菌相似菌株

T: Type strain

      从 NCBI 网站分别下载 13 株相似菌株的 16S rRNA 序列，利用 MAGE 7.0 软件中的 Neighbor-joining 法制作进化树，比对方法为 ClustalW。从发育树 (图 1) 可以看出，WF-1、WF-2、WF-6、WF-12、WF-13 属于 北里孢菌属 (Kitasatospora)，WF-3、WF-4、WF-5、WF-7、WF-8、WF-14、WM-1 和 WM-3 属于 链霉菌属 (Streptomyces)，13 株菌都属于链霉菌科 Streptomycetaceae。菌株 WF-5 与 S. tacrolimicus 相似性最高，同源性为 98.14%，低于 98.65%，且系统发育树处于单独的分枝，推测菌株 WF-5是一株新的链霉菌。


图1. 基于16S rRNA 序列的系统发育树分析 (邻位法)

注意事项

1. 采集到的白蚁材料尽量在新鲜状态下立即解剖，以保证肠道放线菌的分离效果。
2. 在解剖白蚁前，清洗消毒白蚁体表，以防止体外菌的污染。
3. 解剖过程中先将白蚁头部去掉，按住白蚁用解剖针从尾部缓缓拉出肠道，可以保持肠道的完整性。
   

溶液配方

1. PBS缓冲液
   NaCl 4 g，KCl 0.1 g，Na₂HPO₄ 0.72 g，NaH₂PO₄ 0.12 g，加蒸馏水500 ml，pH 7.4
2. 高氏一号培养基 (g/L)
   可溶性淀粉20 g，KNO₃ 1 g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，琼脂18 g，加蒸馏水定容至1 L
3. 可溶性淀粉培养基 (g/L)
   可溶性淀粉10 g，K₂HPO₄ 1 g，MgSO₄ 1 g，NaCl 1 g，(NH₄)₂SO₄ 2 g，CaCO₃ 2 g，微量盐溶液1 ml，加蒸馏水定容至1 L，pH 7.2
4. 1,000×微量盐溶液 (g/L)
   MnCl₂·4H₂O 0.1 g, FeSO₄·7H₂O 0.1 g, ZnSO₄·7H₂O 0.1 g，加蒸馏水定容至1 L
5. 麸皮培养基 (g/L)
   100 g麸皮加入适量水，沸水煮30 min，经纱布去除沉淀后，加蒸馏水定容至1 L
6. LB 培养基 (g/L)
   NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，琼脂15 g，加蒸馏水定容至1 L，液体培养基不加琼脂粉
   

致谢

本项目获得国家重点基础研究发展计划 (973计划，编号：2011CB707402)，国家自然科学基金 (编号：31970119, 31272370, 30870085) 及山东大学微生物技术国家重点实验室自主设置课题的支持。

参考文献

1. 未建华，李净净和倪金凤. (2019). 培菌昆虫相关放线菌的次级代谢产物研究进展. 微生物学报 59(10): 1864-1871.
2. 徐晓, 孙飞飞, 尹彩萍, 王滢和张应烙 (2018). 昆虫共生菌的次级代谢产物研究进展. 微生物学报 58(6): 1126-1140.
3. Aanen, D. K. and Eggleton, P. (2005). Fungus-growing termites originated in African rain forest. Curr Biol 15(9): 851-855.
4. Hager, F. A. and Kirchner, W. H. (2013). Vibrational long-distance communication in the termites Macrotermes natalensis and Odontotermes sp. J Exp Biol 216(Pt 17): 3249-3256.
5. Ramadhar, T. R., Beemelmanns, C., Currie, C. R. and Clardy, J. (2014). Bacterial symbionts in agricultural systems provide a strategic source for antibiotic discovery. J Antibiot (Tokyo) 67(1): 53-58.
6. Wu, Y., Chi, S., Yun, C., Shen, Y., Tokuda, G. and Ni, J. (2012). Molecular cloning and characterization of an endogenous digestive beta-glucosidase from the midgut of the fungus-growing termite Macrotermes barneyi. Insect Mol Biol 21(6): 604-614.