猴胞浆内单精子注射

王燕, 许玉婷, 李春杨 and 孙强

摘要：胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI），是指通过显微操作技术将单个精子注入卵母细胞胞浆内，从而使卵母细胞受精的一种辅助生殖技术。与传统的体外受精相比，ICSI对精子活力、数量及受精能力的要求较低，在临床上是第 2 代“试管婴儿”的关键技术。在科研领域，ICSI 可结合其他生物工程技术，制备基因编辑动物模型。此外 ICSI 也是精子冷冻复苏构建受精胚胎的重要辅助手段。本文详细描述了猴胞浆内单精子注射的操作方法及流程。

关键词: 精子, 卵母细胞, 受精, 辅助生殖

材料与试剂

  1. 3.5 cm 培养皿（CORNING，catalog number: 430165）
  2. 3.5 cm 操作皿（FALCON，catalog number: 353001）
  3. Borosilicate Glass（B100-75-10）
  4. 矿物油（Sigma，catalog number：M8410）
  5. 口吸管（北京正天，catalog number：BJ-40）
  6. 移液枪 （Eppendorf）
  7. 15 ml 离心管（Corning，catalog number：430791）
  8. 一次性使用无菌注射器带针（KDL 1ml）
  9. PVP（Sigma，catalog number：PVP360）
  10. 水银
  11. TH3液（见溶液配方）
  12. T3液（见溶液配方）
  13. HECM9aa培养液（见溶液配方）
  14. NaCl（Sigma-Aldrich，catalog number：S7653）
  15. KCl（Sigma-Aldrich，catalog number：P5405）
  16. CaCl2·2H2O（Sigma-Aldrich，catalog number：C7902）
  17. MgCl2·6H2O（Sigma-Aldrich，catalog number：M2670）
  18. NaH2PO4（Sigma-Aldrich，catalog number：S8282）
  19. NaHCO3（Sigma-Aldrich，catalog number：S5761）
  20. HEPES（Sigma-Aldrich，catalog number：H3375）
  21. D-Glucose（Sigma-Aldrich，catalog number：G7528）
  22. Sodium Pyruvate（Sigma-Aldrich，catalog number：P5280）
  23. Sodium lactate (60% syrup)（Sigma-Aldrich，catalog number：L4263）
  24. BSA（absin，catalog number：abs9156）
  25. penicillin-streptomycin (100X)（gibco，catalog number：15070-063）
  26. PVA（Sigma-Aldrich，catalog number：P8136）
  27. HCl（沪试，catalog number：7647-01-0）
  28. Taurine（Sigma-Aldrich，catalog number：T8691）
  29. Asparagine（Sigma-Aldrich，catalog number：A4159）
  30. Cysteine（Sigma-Aldrich，catalog number：C7352）
  31. Histidine（Sigma-Aldrich，catalog number：H6034）
  32. Lysine（Sigma-Aldrich，catalog number：L5501）
  33. Proline（Sigma-Aldrich，catalog number：L5607）
  34. Serine（Sigma-Aldrich，catalog number：S4311）
  35. Aspartic acid（Sigma-Aldrich，catalog number：A8949）
  36. Glycine（Sigma-Aldrich，catalog number：G8790）
  37. Glutamic acid（Sigma-Aldrich，catalog number：G8415）
  38. Glutamine（Sigma-Aldrich，catalog number：G8540）
  39. Pantothenate（Sigma-Aldrich，catalog number：P5155）
  40. Phenol Red（Sigma-Aldrich，catalog number：P0290）

仪器设备

  1. 培养箱（Thermo Scientific，model：Forma 3111、Forma 371）
  2. 拉针仪（Sutter Instrument， model：P97）
  3. 断针仪（Narishige， model：MF-900）
  4. 倒置显微镜（Olympus，model：IX-73）
  5. 体视显微镜（Olympus，model：SZX7）
  6. 一对显微操作臂（Narishige）
  7. 微量注射器（Narishige IM-9B）
  8. 离心机（Eppendorf centrifuge，model：5702）
  9. 压电冲击驱动系统（Prime Tech）

实验步骤

实验流程

  1. 超排母猴及获取卵母细胞；
  2. 猴子精子的采集与获能处理；
  3. 完成注射，将卵子移入培养碟中放置培养箱培养；
  4. 做好详细记录。

单精注射步骤
一、精子获能处理

  1. 将采集的精子液化15-20 min，取液化好的精子上清加入到15 ml离心管内；
  2. 在精子离心管内加入4 ml的TH3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
  3. 离心完后去上清，再加入4 ml的TH3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
  4. 离心完后去上清，再加入4 ml的T3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
  5. 离心完后去上清，再加入2 ml的T3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
  6. 离心完后等待精子上游，上游3分钟；
  7. 上游后取中层的精子，在培养皿内制备精子滴，盖上矿物油，放入培养箱待用。

二、单精子显微注射

  1. 将TH3显微注射操作皿做好预热：取200 μl TH3液，在显微操作碟内制备4-5滴TH3液滴和一个柱状TH3液滴，再做一个10% PVP的液滴，每滴体积15-20 μl，并覆盖矿物油；
  2. 将HECM9aa培养皿做好预热：取200 μl HECM9aa培养液，在培养皿内制备10-13个液滴，每滴体积约15-20 μl，并覆盖矿物油。
  3. 用拉针仪将1 mm外径的薄壁硼硅酸毛细玻璃管（B100-75-10）拉制成需要的内外径后，在断针仪上断成外径为100-110 μm和内径为15-20 μm，打弯成20-30度的持卵针；
  4. 用拉针仪将1 mm外径的薄壁硼硅酸毛细玻璃管（B100-75-10）拉制成需要的内外径后，在断针仪上断成外径为7-8 μm和内径为5-6 μm，打弯成20-30度的精子注射针；
  5. 用1 ml注射器从注射针的末端装入1-2 mm水银待用；
  6. 将制备的显微注射皿放置于载物台上，从低倍视野开始观察整个显微操作滴；
  7. 将持卵针安装于操作仪左侧的IM9B，缓慢深入注射滴中，并调整与操作皿底部水平；
  8. 将注射针安装于操作仪右侧的piezo压电冲击驱动系统的微注射器上，缓慢深入注射滴中，并调整与操作皿底部水平，保持与持卵针在同一水平线；
  9. 用胚胎转移管将一组MII期卵母细胞转移到操作皿TH3液滴中，同时将处理的3-5 μl获能精子加到另一个TH3液滴内；
  10. 镜下在10% PVP内清洗注射针并调整注射针到精子滴中，用注射针尖轻击精子尾部来制动精子后，将精子尾先头后吸入注射针内，移动注射针到放置卵母细胞的注射滴中（当注射针内的精子用完后，重复此步骤）；
  11. 用持卵针抓取并固定MII期卵母细胞，并调整第一极体在六点或十二点的方向，注射针利用脉冲震荡刺穿破透明带，将精子推到注射针口后通过脉冲震荡辅助注射入卵母细胞内，以尽量少的液体吐出精子；（见图1、图2）


    图1. 极体在约 6 点方向，脉冲震荡刺穿破透明带


    图2. 精子推到注射针口，准备进行注射

  12. 完成注射后，持卵针放开卵母细胞；
  13. 重复上述操作直至完成所有的MII期卵母细胞的精子注射，将胚胎转移到HECM9aa培养液中在 37 °C，5% CO2培养箱中培养；
  14. 培养箱中培养六个小时以上，在显微镜下检查原核形成情况，出现两个原核的胚胎视为正常受精。（见图3）


图3. 受精卵，箭头所指处为两原核位置

注：本文以7只供体数，共获取103枚卵母细胞进行ICSI，其中有91枚正常受精，受精率达88%。（见表1）

表1. ICSI数据统计
供体数 注射卵母细胞数 受精数 受精率
1# 6 5
2# 20 14
3# 2 2
4# 20 19
5# 5 5
6# 27 25
7# 23 21
总计 103 91 88%


溶液配方

  1. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3)（表2）

    表2. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3) 配制表
    成分 /100ml /50ml 备注
    NaCl 3.329 ml 1.665 ml 200 mg/ml stock
    KCl 239 μl 119.5 μl 100 mg/ml stock
    CaCl2·2H2O 294 μl 147 μl 100 mg/ml stock
    MgCl2·6H2O 102 μl 51 μl 100 mg/ml stock
    NaH2PO4 48 μl 24 μl 100 mg/ml stock
    NaHCO3 210.6 mg 105.3 mg
    HEPES 240 mg 120 mg
    D-Glucose 90 mg 45 mg
    Sodium Pyruvate 12 mg 6 mg
    Sodium lactate (60% syrup) 0.17 ml 85 μl
    BSA 300 mg 150 mg
    penicillin-streptomycin (100X) 1 ml 500 μl
    Phenol Red (0.01%) 10 μl 5 μl
    pH 7.4

  2. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium without HEPES (T3)（表3）

    表3. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium without HEPES (T3) 配制表
    成分 /100ml /10ml 备注
    NaCl 3.329 ml 333 μl 200 mg/ml stock
    KCl 239 μl 23.9 μl 100 mg/ml stock
    CaCl2·2H2O 294 μl 29.4 μl 100 mg/ml stock
    MgCl2·6H2O 102 μl 10.2 μl 100 mg/ml stock
    NaH2PO4 48 μl 4.8 μl 100 mg/ml stock
    NaHCO3 210.6 mg 21.06 mg
    Glcose 90 mg 9 mg
    Sodium Pyruvate 12 mg 1.2 mg
    Sodium lactate (60% syrup) 0.17 ml 17 μl
    BSA 300 mg 30 mg
    penicillin-streptomycin (100X) 1 ml 100 μl
    Phenol Red (0.01%) 10 μl 1 μl
    pH 7.4

  3.  HECM-9（表4）

    表4. HECM-9 配制表
    成分 /100ml 终浓度
    NaCl 0.6639 g 113.6 mmol/L
    KCl 0.0224 g 3 mmol/L
    CaCl2·2H2O 0.0279 g 1.9 mmol/L
    MgCl2·6H2O 0.0102 g 0.5 mmol/L
    NaHCO3 0.2100 g 25 mmol/L
    Sodium lactate (60% syrup) 0.0504 g 4.5 mmol/L
    PVA 0.01 g 0.1 mg/ml
    1 mol/L HCl 0.14 ml 1.4 mmol/ml
    11 AA with Pantothenate 1 ml
    100X AA stock
    成分 MW 100X 母液浓度 终浓度
    Taurine 125 50 mmol/L 0.5 mmol/L
    Asparagine 132 1 mmol/L 0.01 mmol/L
    Cysteine 121 1 mmol/L 0.01 mmol/L
    Histidine 155 1 mmol/L 0.01 mmol/L
    Lysine 146 1 mmol/L 0.01 mmol/L
    Proline 115 1 mmol/L 0.01 mmol/L
    Serine 105 1 mmol/L 0.01 mmol/L
    Aspartic acid 133 1 mmol/L 0.01 mmol/L
    Glycine 75 1 mmol/L 0.01 mmol/L
    Glutamic acid 147 1 mmol/L 0.01 mmol/L
    Glutamine 146 20 mmol/L 0.2 mmol/L
    Pantothenate 238 0.3 mmol/L 3 μmol/L
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Copyright: © 2023 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：王燕, 许玉婷, 李春杨, 孙强. (2023). 猴胞浆内单精子注射. // 实验动物胚胎操作实验手册. Bio-101: e1010985. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010985.
How to cite: Wang, Y., Xu, Y. T., Li, C. Y., and Sun, Q. (2023). Intracytoplasmic Sperm Injection of Monkeys. // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals. Bio-101: e1010985. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010985.
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