鸡胚胎干细胞分离培养及鉴定

材料与试剂

1. 离心管
2. 玻璃吸管
3. 新鲜受精蛋（扬州翔龙禽业发展有限公司）
4. Knockout DMEM (Gibco, catalog number: 10829018)
5. 胎牛血清（Gibco, catalog number: 10099141）
6. β-巯基乙醇（Sigma, catalog number: M3148）
7. 丙酮酸钠（Gibco, catalog number: 11360-070）
8. L-谷氨酰胺（sigma, catalog number: 59202C）
9. 非必需氨基酸（Sigma, catalog number: M7145）
10. mLIF（Millipore, catalog number: ESG1106）
11. bFGF（Sigma, catalog number: F0291）
12. hSCF（Sigma, catalog number: S7901）
13. 鸡血清（Gbico, catalog number: 16110-082）
14. 青链霉素（Solarbio, catalog number: P1400-100）
15. 碱性磷酸酶染色试剂盒（索莱宝，货号：G1480）
16. SSEA-1（Biolegend, San Diego, CA; dilution ratio 1:100）
17. 4%多聚甲醛（Solarbio, catalog number: P1110）
18. Triton X-100（索莱宝，货号：T8200）
    
19. Tween-20（索莱宝，货号：T8220）
20. 新洁尔灭
21. ESCs因子培养基（见溶液配方）[1,2]
22. 1% Triton（见溶液配方）
23. 封闭液（见溶液配方）
24. PBS-T（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 镊子
2. 药匙
   
3. 培养皿
4. 325目钢筛
5. 微量移液器
6. 台式低速自动平衡离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，TDZ4-WS）
7. 荧光倒置显微镜（OLYMPUS，IX51）
8. 超净工作台
   

实验步骤

一、ESCs的分离

1. 取新鲜受精蛋，依次用新洁尔灭，75%酒精将鸡蛋表面清洗干净，置于超净工作台中。
2. 利用钝端镊子对准鸡蛋的赤道面进行开口，弃去上端蛋壳。
3. 左手握着下端蛋壳，右手用钝端镊子紧贴蛋壳壁旋转一圈，将蛋清去除，游离蛋黄。
4. 利用药匙拨动蛋黄，找到胚盘，眼科剪刀沿着胚盘边缘卵黄膜剪成四边形或三角形，用钝端镊子夹起四边形或三角形卵黄膜（包含胚盘）的一角，小心取出放入含PBS（37 °C左右）的60 mm细胞培养皿中。
5. 轻轻晃动培养皿，注意观察胚盘情况，直至圆形胚盘从卵黄膜上脱离出来。
6. 利用玻璃吸管将胚盘置于PBS溶液中清洗3遍，收集胚盘至15 ml离心管。用玻璃吸管充分吹散胚盘呈单细胞悬液。
7. 用325目钢筛过滤细胞悬液，高速1,000 x g离心6-8 min，收集沉淀，加入ESCs因子培养基，充分吹散重悬，计数，以5×10⁶个细胞接种于60 mm培养皿，置于37 °C，5% CO₂培养箱中培养12 h，进行细胞差速贴壁培养。

二、ESCs的培养

1. 弃去培养12 h的皿中上清，用微量移液器吸取ESCs因子培养基冲刷培养皿底部来收集细胞悬液，置于15 ml离心管中，吹散。
2. 台式低速自动平衡离心机高速1,000 x g离心6-8 min。
3. 弃去上清，收集细胞沉淀，加ESCs因子培养基，微量移液器充分吹散重悬。
4. 台式低速自动平衡离心机低速550 x g离心6-8 min后弃去上清。
5. 加入ESCs因子培养基吹散重悬，以5×10⁶个细胞重新接种于60 mm细胞培养皿，37 °C 5% CO₂培养箱培养。

三、ESCs的鉴定

1. 利用倒置显微镜观察鸡ESCs的生长情况和形态特征。
2. 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AKP）活性鉴定：
   1. 取生长良好的ESCs，吸出60mm培养皿中的原培养液，缓慢加入PBS溶液，轻柔漂洗3遍。
   2. 缓慢加入AKP固定液固定3分钟，吸出后PBS轻柔漂洗1遍。
   3. 缓慢 加入ALP孵育液，避光15-20分钟，吸出后PBS轻柔漂洗1遍。
   4. 缓慢加入核固红染色或者甲基绿染色液复染3-5分钟，吸出液体。
   5. PBS清洗1遍，置于倒置显微镜下观察。
3. SSEA-1间接免疫荧光鉴定[3]
   1. 取生长良好的ESCs，吸出原培养液，缓慢加入PBS溶液，轻柔漂洗1遍。
   2. 缓慢加入4%多聚甲醛固定30分钟，缓慢吸出上清，用PBS进行清洗。
   3. 缓慢加入1% Triton-100透膜处理20分钟，缓慢吸出上清，用PBS轻柔清洗1遍。
   4. 缓慢加入封闭液（10% FBS的PBS）37 °C避光封闭2h。
   5. 缓慢吸出上清，缓慢加入SSEA-1抗体，37 °C孵育2小时或4 °C过夜
   6. 缓慢吸出上清，加入PBS-T清洗3次，每次5 min。
   7. 滴加二抗，37 °C避光孵育2h，吸出上清，PBS-T轻柔清洗3次，每次5min。
   8. 5 ng/μl DAPI染色10分钟后，吸出上清，加入PBS。
   9. 抗荧光淬灭封片剂封片，显微镜下观察。

结果与分析

1. 鸡ESCs形态观察
   分离后的ESCs进行在因子培养基中进行无饲养层培养并传代，ESCs的细胞形态较小，且培养后传代，逐渐形成鸟巢状（图1）。
   
   
   图1. ESCs传至第三代的细胞形态图，→所示为鸟巢状ESCs克隆，标尺：60 μm
   
   
2. 碱性磷酸酶（AKP）活性鉴定
   通过碱性磷酸酶染色试验发现ESCs克隆能够被染色为橘黄色，表现出碱性磷酸酶活性（图2）。
   
   
   图2. ESCs的AKP染色鉴定，→所示为鸟巢状ESCs克隆被染成黄色，标尺：20 μm
   
   
3. SSEA-1间接免疫荧光鉴定
   经间接免疫荧光鉴定分析发现ESCs能够通过标记上SSEA-1，表达绿色荧光（图3）。
   
   
   图3. ESCs细胞克隆的SSEA-1的鉴定，标尺：50 μm
   

溶液配方

1. ESCs因子培养基（郑蒙蒙等，2013）
   Knockout DMEM
   10% FBS
   0.1 mmol/L β-巯基乙醇
   1 mmol/L丙酮酸钠
   2 mmol/L的L-谷氨酰胺
   1%非必需氨基酸
   1,000 IU/mL LIF
   10 ng/mL bFGF
   5 ng/mL SCF
   1%的双抗
   2%鸡血清
2. 1% Triton
   1% Triton的PBS
   10 μl Triton加入990 μl PBS中。
3. 封闭液
   10% FBS的PBS
   1 ml FBS加入9 ml的PBS
4. PBS-T
   0.05% Tween-20的PBS
   5 μl Tween-20加入995 μl PBS中
   

致谢

本研究得到了国家自然科学基金资助项目（31872341；31572390）、重点科研项目（2017YFE0108000）和江苏省优势学科的资助。感谢张振韬、郑蒙蒙、赵瑞丰、黄晓梅等的研究工作。

参考文献

1. 赵瑞丰. 鸡CEF重编程成为PGC诱导体系的建立及其迁移归巢功能的研究.扬州:扬州大学.2018.
2. 郑蒙蒙,李伟,张亚妮,等.鸡胚胎干细胞无饲养层培养体系的建立及其转染体系的优化.中国畜牧杂志, 2013(17):22-26.
3. Zhang, Z., Elsayed, A. K., Shi, Q., Zhang, Y., Zuo, Q., Li, D., Lian, C., Tang, B., Xiao, T., Xu, Q., Chang, G., Chen, G., Zhang, L., Wang, K., Wang, Y., Jin, K., Wang, Y., Song, J., Cui, H. and Li, B. (2015). Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. J Biol Chem 290(21): 13605-13621.

Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.

引用格式：张晨, 赵瑞丰, 郑蒙蒙, 戴建明, 孙红艳, 左其生, 张亚妮, 李碧春. (2022). 鸡胚胎干细胞分离培养及鉴定. // 实验动物胚胎操作实验手册. Bio-101: e1010954. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010954.
How to cite: Zhang, C., Zhao, R. F., Zheng, M. M., Dai, J. M., Sun, H. Y., Zuo, Q. S., Zhang, Y. N. and Li, B. C. (2022). Isolation, Culture and Identification of Chicken Embryonic Stem Cells . // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals. Bio-101: e1010954. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010954.