长爪沙鼠胚胎显微注射（胞浆注射）
Embryo Microinjection (Cytoplasm Injection) in Mongolian Gerbils   

材料与试剂

1. M2培养基（美国Sigma Aldrich公司，catalog number: M7167）
2. 石蜡油（美国Sigma Aldrich公司，catalog number: M8410）
3. 透明质酸酶（美国Sigma Aldrich公司，catalog number: H3506）
4. 35 mm、10 cm细胞培养皿（美国Corning公司，catalog number: 430165，430167）
5. 显微注射针（德国Eppendorf公司，catalog number: D264750N）
6. 移卵用2.5 mm毛细玻璃管（北京正天易科贸有限责任公司，catalog number: BJ40）
7. 透明质酸酶溶液（见溶液配方）
   

仪器设备

1. 显微操作注射系统（德国Eppendorf公司，model: 51760018）
2. 荧光倒置相差显微镜（德国Leica公司，model: DMi8）
3. 恒温二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司，model: Heracell VIOS 250i）
4. 煅针仪（日本成茂公司，model: MF-900）
   

实验步骤

1. 取卵前准备
   取卵前一天即制作微滴培养系统：向35 mm细胞培养皿中滴加M2培养基，每一滴约20 μl，并加入2 ml石蜡油完全覆盖M2培养液滴，将该培养系统放置于CO₂培养箱中平衡过夜，培养条件为37°C、5% CO₂和饱和湿度。同时将分装M2培养基和自制M2培养液放置于CO₂培养箱中平衡过夜。
   
2. 取输卵管
   在激素注射的第五天（即hCG注射并合笼后的第二天早上）9～10时，将沙鼠于超净工作台中断颈处死，腹部朝上放置于擦手纸上，用75%酒精喷洒沙鼠腹部进行消毒。用手术剪和镊子剖开腹部，暴露腹腔，并沿沙鼠子宫找到沙鼠的输卵管和卵巢，剪下沙鼠的输卵管，收集到预热的M2培养基中。
   
3. 取卵
   向10 cm细胞培养皿中滴加200 μl预热的M2培养基，并在体视解剖镜下依次将沙鼠输卵管放在M2液滴中，在镜下用显微镊划开输卵管膨大部时沙鼠受精卵团流出。之后将获得的沙鼠受精卵用100 μl浓度为300 μg/ml的透明质酸酶消化约1分钟，期间用200 μl移液器进行吹打，辅助消化。
   
4. 洗卵和培养
   向10 cm细胞培养皿中滴加4滴预热的M2培养基，每滴约50 μl。将获得的与卵丘细胞分离的沙鼠受精卵转用口吸管移到新的M2微滴中进行清洗，一共清洗3～4次，直至卵丘细胞完全脱落。用口吸管将洗净的受精卵转移到事先准备好的微滴培养基中，放置于CO₂培养箱中进行培养。
   
5. Cas9/gRNA注射体系准备
   用DEPC水稀释gRNA和Cas9蛋白质（M0646T，NEB），使gRNA的终浓度为50 ng/μl、Cas9蛋白质为32 ng/μl。稀释后的混合液在4 °C下14,000 × g离心30分钟，上清液分装后-80 °C保存，注射前冰上融化。
   
6. 显微注射系统的安装
   在带有金属支架的玻璃注射皿中滴加M2液滴，用石蜡油进行覆盖，并在CO₂培养箱中37 °C平衡2小时以上。之后调节显微注射显微镜和显微操作仪。其中，显微注射Cas9/gRNA体系冰上溶解后，4 °C下14,000 rcf离心15分钟，用移液器将上清液加到注射针中，去除气泡。
   
7. 胞质显微注射
   在下午2时左右（沙鼠原核期受精卵比例最高），将上午10时左右培养的沙鼠受精卵取出，在M2培养基中清洗一次后，用口吸管将受精卵转移到显微注射的M2微滴中，用显微注射仪将Cas9/gRNA体系注射到长爪沙鼠受精卵的胞质中，注射剂量为3～10 pL。显微注射完成后，用口吸管将存活的受精卵转移到新的M2微滴中，在CO₂培养箱中继续进行培养或进行胚胎移植。
   

溶液配方

1. 透明质酸酶溶液
   将30 mg透明质酸酶加入到3 ml M2培养基溶解，获得10 mg/ml储备溶液。储存于-20°C冰箱。
   使用时用M2培养基稀释至 300 μg/ml的最终工作浓度。
   

致谢

1. 本研究得到国家自然科学基因（31672375, 31872308, 31970512, 31572348）和“十三五”时期北京市属高校高水平教师队伍建设支持计划(IDHT20170516)资助。
2. 感谢清华大学实验动物中心常在主任和中国科学院动物研究所实验动物中心多曙光主任在受精卵注射方面的支持与帮助。
   

参考文献

1. 王妍. (2019). 利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除长爪沙鼠动物模型. 首都医科大学硕士学位论文.
2. Wang, Y., Zhao, P., Song, Z., Du, X., Huo, X., Lu, J., Liu, X., Lv, J., Li, C., Guo, M. and Chen, Z. (2020). Generation of gene-knockout Mongolian gerbils via CRISPR/Cas9 system. Front Bioeng Biotechnol 8: 780.