线粒体质量定量分析

材料与试剂

1. Corning® 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Corning, catalog number: 3603)
2. Corning® 100 mm TC-treated Culture Dish (Corning, catalog number: 430167)
3. Poly-L-ornithine hydrobromide (PLO) (Sigma, catalog number: P3655)
4. Laminin (Sigma, catalog number: L2020)
5. DMEM/F-12 (BI, catalog number: 01-172-1ACS)
6. STEMdiff™ Neural Progenitor Medium (STEMCELL, catalog number: 05833)
7. AccutaseTM (STEMCELL, catalog number: AT-104)
8. DPBS (BI, catalog number: 02-023-1ACS)
9. DAPI (Sigma, catalog number: D9542 )
10. 4%PFA (BBI, catalog number: E672002)
11. MitoTracker® Red CMXRos (Invitrogen, catalog number: M7512)
12. MitoTracker工作液浓度 (50μM) (见溶液配方)
13. PBST (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 细胞培养箱 (Eppendorf, model: C170i)
2. 全自动细胞计数仪 (Countstar, model: Countstar FL)
3. 高通量活细胞分析仪 (Thermo Fisher Cellomics, model: VTI700)
   

软件

1. HCS studio细胞分析软件

实验步骤

一、包被96孔板

1. 将Poly-L-ornithine hydrobromide (PLO) (Sigma, catalog number: P3655) 按照1:200稀释到DPBS中，每孔加入50 μl，放置4 °C过夜。
2. 弃去PLO，用DPBS洗三遍。将Laminin 按照1:200稀释到DMEM/F-12中，每孔加入50 μl，放置4 °C过夜。
   
   
   

1. 待神经干细胞汇合度达到70%时可以传代，这时弃去神经干细胞培养基。
2. 用3 ml无菌DPBS清洗培养皿一次，吸走DPBS。
3. 加入1 ml Accutase^TM消化神经干细胞。
4. 弃去Accutase^TM，在37 °C下孵育3 min。
5. 将细胞重悬于2 ml 神经干细胞培养基中。
6. 消化计数，按5000 cells/well接种96孔板中。
7. 将96孔板放在37 °C的培养箱中。 以几次快速，短暂，前后和左右移动的方式移动培养板使细胞均匀分布在板底。

三、48 h后进行线粒体染色
按照1:500稀释储存液浓度为50 μM MitoTracker® Red CMXRos 于培养基中，37 °C孵育1 h。

四、MitoTracker染色1 h后PFA固定，DAPI染色

1. 取出96孔板，弃去培养基。所接种的细胞全部DPBS洗后PFA固定。
2. 加50 μl 4% PFA固定15 min，倒掉。
3. 加50 μl PBST (0.1% Triton X-100) 通透15 min，倒掉。
4. 按照1:1000稀释1 mg/ml DAPI 50 μl 染色15 min，倒掉。
5. 加100 μl DPBS 洗三遍，倒掉。
   
   
   

五、数据分析
采用HCS studio进行神经干细胞线粒体活性定量分析。

结果与分析

一、结果


图1. 在96孔黑边框透明底板上用MitoTracker® Red CMXRos染色的神经祖细胞的荧光图像

二、分析

1. 打开Cellomics软件，选择General Colocalization Measurement Tool，根据实验条件适当地修改分析方法。
   
   
   图2. 选择General Colocalization Measurement Tool进行分析
   
   
2. 点击Configure Groups导入图片
   
   
   图3. 导入其中一孔的图片作为分析参考
   
   
3. 调整Task Settings中的参数，根据DAPI将细胞定位。
   
   
   图4. DAPI确定细胞位置
   
   
4. 选择Select Primary Objects channel 2将线粒体定位。
   
   
   图5. 确定线粒体的位置
   
   
5. Select features to store选择平均荧光强度参数
   
   
   图6. 分析参数的确定
   
   
6. Scan plate开始分析。
7. Launch view得到细胞数量和总荧光强度结果
   
   
   图7. 导出后的细胞数量
   
   
   图8. 导出后线粒体总荧光强度
   
   
8. 高内涵统计数据分析：
   以B2，C2，D2孔为例：
   
   表1. 每个细胞中线粒体的荧光强度计算示例
   
   
   解析：表格里面的DAPI个数是以细胞核为分析通道进行统计出来的，DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，可以准确的分析细胞个数。而线粒体的总荧光强度是根据线粒体轮廓来确定。得到的总荧光强度/细胞数，就是每个细胞中线粒体的荧光强度。
   
   
   图9. 神经干细胞被药物作用后每个细胞线粒体荧光强度变化
   
   解析：将分析的数据以柱状图的形式呈现，通过总荧光强度/细胞数探究7种药对线粒体荧光强度的影响。

溶液配方

1. 探针母液 (1 mM) 配制：将冻干粉升温至室温，溶解在DMSO中，最终浓度为 1 mM。
2. 储存液浓度 (50 μM) 配制：10 μl 1 mM (Mitotracker) + 190 μl DPBS = 50 μM储存液即500x浓缩液。
3. PBST：0.1% Triton X-100溶于DPBS中。
   

致谢

感谢国家蛋白质中心复合激光显微镜系统提供高内涵细胞分析仪的设备及技术人员的辅助。该项目受国家重点研发计划 (项目编号2018YFA0107903) 和 (项目编号2017YFA0104102)，国家自然科学基金 (项目编号81701054) 的支持资助。

参考文献

1. Cottet-Rousselle, C., Ronot, X., Leverve, X. and Mayol, J. F. (2011). Cytometric assessment of mitochondria using fluorescent probes. Cytometry A 79: 405-425。