神经干细胞诱导分化形成的神经元及神经网络的定量分析
The Quantitative Analysis of Neuronal Structure   

材料与试剂

1. Corning^® 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Corning, catalog number: 3603)
2. Corning^® 100 mm TC-treated Culture Dish (Corning, catalog number: 430167)
3. Corning^® Matrigel^® hESC-Qualified Matrix (Corning, catalog number: 07181)
4. STEMdiff^TM Neural Progenitor Medium (STEMCELL, catalog number: 05833)
5. Accutase^TM (Stemcell, catalog number: 07922)
6. DPBS (BI, catalog number: 02-023-1 ACS)
7. DAPI (Sigma, catalog number: D 9542)
8. Anti-Tuj1 antibody (Sigma, catalog number: T 8660)
9. Donkey anti-Mouse 488 (Invitrogen, catalog number: A-21202)
10. 4% 多聚甲醛固定液 (BBI, catalog number: E 672002)
11. STEMdiff^TM Neural Progenitor Medium（Stemcell, catalog number:05833）
12. Normal Donkey Serum (Jackson, catalog number:017-000-121)
13. N2 Supplement-A (Stemcell, catalog number: 07152)
14. NeuroCult™ SM1 Neuronal Supplement (Stemcell, catalog number: 05711)
15. BrainPhy Neurobasal Medium (Stemcell, catalog number: 05790)
16. Culture one (Gibco, catalog number: A3320201)
17. Triton X-100 (BBI, catalog number: A600198)
18. Hu Recom BDNF (Stemcell, catalog number:78005.1)
19. Hu Recom GDNF (Stemcell, catalog number:78058.1)
20. Hu Recom IGF-I (Stemcell, catalog number:78022.1)
21. L-Ascorbic acid (Sigma，catalog number:A4403)
22. cAMP（Sigma，catalog number: D-0260-5MG）
23. 抗体稀释液（见溶液配方）
24. 封闭缓冲液（见溶液配方）
25. 神经分化培养基（见溶液配方）

仪器设备

1. 细胞培养箱（Eppendorf, C 170i）
2. 离心机（Eppendorf, 5810 R,）
3. 全自动细胞计数仪（Countstar, Countstar FL）
4. 高通量活细胞分析仪（Thermo Fisher Cellomics, VTI 700）
   

实验步骤

1. 将神经干细胞种到96孔板
   1.1

   弃去培养在10cm皿中的神经干细胞的STEMdiff™ Neural Progenitor Medium。
   1.2

   用3 ml无菌DPBS清洗培养皿一次，吸走DPBS。
   1.3

   加入1 ml AccutaseTM，漂洗细胞，弃去AccutaseTM。
   1.4

   在少量AccutaseTM存在的情况下，37 °C下孵育3 min。
   1.5

   将神经干细胞重悬于2 ml STEMdiffTM Neural Progenitor Medium中。
   1.6

   消化计数，按5,000 cells/well接种96孔板中。
   1.7

   将96孔板放在37 °C的培养箱中。以几次快速，短暂，前后和左右移动的方式移动培养板使细胞均匀分布在板底。
2. 24 h后进行神经分化
   2.1

   弃去培养基。
   2.2

   每孔加入100 μl DPBS清洗一次，吸走DPBS。
   2.3

   每孔加入50 μl的神经分化培养基及促分化药物，其中对照组为神经分化培养基，加药组是在神经分化培养基添加合适浓度的促神经分化药物。
   2.4

   每两天换液，10天后用4% PFA固定。
3. 免疫荧光染色
   3.1

   取出96孔板，弃去培养基。
   3.2

   加50 μl 4% PFA在37 °C条件下固定15 min，倒掉。
   3.3

   加PBST (0.1% Triton X-100) + 5% 驴血清在37 °C条件下通透15 min，倒掉。
   3.4

   每孔加入100 μl封闭液，室温封闭30 min。
   3.5

   mouse anti-Tuj1抗体在抗体稀释液按1：200稀释，每孔50 μl，4 °C过夜。
   3.6

   加100 μl PBS，室温洗三次。
   3.7

   Donkey anti-Mouse 488抗体用抗体稀释液按1：500稀释，每孔50 μl，孵育2 h。
   3.8

   加100 μl PBS，室温洗三次。
   3.9

   按照1：1,000稀释1 mg/ml DAPI 50 μl 染色15 min，倒掉。
   3.10

   加100 μl PBS 洗三遍，倒掉。
   3.11

   加100 μl PBS，保存于4 °C。
   
   

结果与分析

图 1. 神经干细胞。（绿色：Nestin，红色：Sox2，蓝色：DAPI）


图 2：不同药物处理的神经干细胞分化的神经元。（绿色：Tuj1，红色：Sox2，蓝色：DAPI）
A: 未处理对照组 B: 加药处理组


图3:高内涵分析神经元结构相关参数
注：NC 为未加药处理对照组, Drug1 为经促神经分化药物处理后的样品组A：平均轴突长度 B：平均节点数目 C：平均轴突数目 D 分化成神经元（轴突数大于1）的细胞比例

高内涵成像部分
1.将96孔板用擦镜纸擦拭板底后，放入高内涵仪器中进行成像。
2.使用20× 长工作距离物镜，打开Harmony 软件，添加绿色 (Ex 460-490/Em 500-550)，蓝色（Ex 360-400/ Em 410-480）成像通道，每孔选择9个视野进行拍摄。
3.根据荧光强度调整曝光时间，聚焦高度，激发光强度进行实验拍摄。
4.成像后利用Harmony 软件进行神经元的分析计算，计算流程及说明见表1，成像图例见图1、图2，分析结果见图3。

表1. Harmony 软件高内涵分析流程及说明

溶液配方

1. 抗体稀释液
   1% Donkey Serum稀释至含有0.1% Triton X-100的PBS中
2. 封闭缓冲液
   10% Donkey Serum稀释至含有0.1% Triton X-100的PBS中
3. 神经分化培养基
   BrainPhy Neurobasal Medium 培养基中分别加入1 x N2 supplement、1 x NeuroCult™ SM1 Neuronal Supplement、1 x NeuroCult™ SM1 Neuronal Supplement、1 x Cultureone及终浓度为0.1nM的cAMP、200μg/ml的Ascorbic acid、10ng/ml 的BDNF、GDNF和IGF-I。
   

致谢

感谢国家蛋白质中心复合激光显微镜系统提供高内涵细胞分析仪的设备及技术人员的辅助。该项目受国家重点研发计划2018YFA0107903和2017YFA0104102，国家自然科学基金81701054的支持资助。