利用荧光素酶报告系统高通量筛选影响蛋白表达的活性小分子
High Throughput Screening for Active Small Molecules Affecting Protein Expression by Luciferase Reporter System   

材料与试剂

1. 384孔板 (Corning, catalog number: 3765)
2. 96孔板 (Corning, catalog number: 3879)
3. 15 ml离心管 (Thermo Scientific Nunc, catalog number: 339650)
4. 50 ml离心管 (Thermo Scientific Nunc, catalog number: 339652)
5. 10 cm 培养皿 (Thermo Scientific Nunc, catalog number:150466)
6. 野生型SH-SY5Y细胞系 (American Type Culture Collection, ATCC)
7. 敲入荧光素酶编码序列的SH-SY5Y敲入细胞系 (利用CRISPR/Cas 9系统编辑野生型细胞系基因组而获得)
8. ONE-Glo™ Luciferase Assay System (Promega, catalog number: E6130)
9. 0.25% Trypsin-EDTA (Gibco, catalog number: 25200072)
10. FBS (Gibco, catalog number: 10099141)
11. Penicillin/Streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010)
12. PBS (Gibco, catalog number: 10010023)
13. DMEM (Gibco, catalog number: 11965092) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. Multidrop™ Combi 自动分液器 (Thermo Fisher)
2. Bravo自动化液体处理平台 (Agilent)
3. Envision多标记微孔板检测仪 (PerkinElmer)
4. 全自动细胞计数仪 (Bodboge)
   

实验步骤

1. 向培养于10 cm培养皿中的野生型SH-SY5Y细胞系和luciferase敲入细胞系 (密度约为90%) 加入1 ml 0.25% Trypsin-EDTA，置于37 °C培养箱消化5 min，再加入等量的DMEM培养液终止消化，用移液枪吹散成单细胞悬液，400 × g，室温离心2 min。
2. 去除包含胰酶的上清液，加入适量DMEM培养液将细胞重悬，并使用细胞计数仪测量细胞数量。最后将细胞悬液稀释至约2.86 × 10⁵个/ml。
3. 使用Multidrop自动分液器将细胞铺到384孔板中，每孔35 μl (约10,000个细胞)。其中，最左侧两列为野生型SH-SY5Y细胞 (阴性对照，图1)，其余为基因敲入细胞系。
4. 400 × g，室温离心2 min，辅助细胞贴壁。之后置于37 °C培养箱培养。
5. 细胞培养约18 h后，使用Bravo自动化液体处理平台将待筛选的活性小分子加入384孔板中，400 × g，室温离心2 min后，置于37 °C培养箱培养。
   注：1 μl体积的1mM活性小分子分装在96孔板中，使用前需将其解冻，再加入100 μl DMEM溶液进行稀释。最终取3.5 μl加入到384孔板中，终浓度为10 μM。另外，一般分装活性小分子的96孔板最外侧两列为DMSO，故最终384孔板最左侧及最右侧两列孔中的细胞为DMSO处理组。
6. 经活性小分子处理48 h后，将37 °C预热的 ONE-Glo™荧光素酶底物原液加入384孔板中，每孔35 μl。在震动摇床上以300 rpm的速度混匀2 min后，400 × g，室温离心2 min。
   注：若离心后孔内仍有气泡，可去掉384孔板的盖子，提高转速，继续离心。
7. 用Envision多标记微孔板检测仪检测luminescence，每孔检测时长为0.2 s。
8. 根据luminescence结果，与对照组 (DMSO处理组) 进行比较，本实验设定luminescence值小于对照组平均值的50%即为初筛阳性活性小分子。在进行数据的统计与分析时，需计算对照组各孔luminescence值的变异系数 (Coefficient of Variation)。本实验设定，若一块384孔板上对照组的变异系数小于20%，表明这块板上的实验结果较为稳定，可按照“luminescence值小于对照组平均值的50%”这一标准去筛选阳性结果；相反，若变异系数大于20%，则需考虑重做实验，或者放松这一标准 (例如，luminescence值小于对照组平均值的60%)，以免错过某些重要的活性小分子。之后，从96孔板中将初筛阳性小分子逐一挑出，整合至新的96孔板中，进行复筛。
9. 复筛实验流程同初筛。
   注：本实验中初筛未设置复孔，复筛设置了2个复孔。部分小分子在高浓度下对细胞具有较强毒性，若初筛阳性小分子数量不多，在复筛阶段可增设低浓度组。
   

结果与分析

本实验中一块384孔板经Envision多标记微孔板检测仪检测luminescence的读数如图1所示。1、2列 (绿色区域) 为野生型SH-SY5Y细胞读数结果，即阴性对照；23、24列 (蓝色区域) 为DMSO处理的敲入细胞系读数结果，中间 (3-22列) 为敲入细胞系经活性小分子处理48 h后的读数结果。对照组 (蓝色区域) 读数的平均值为13,066.91，标准差为1316.96，变异系数为10.08%，对照组平均值的50%为6533.45。图中黄色区域读数小于6533.45，对应的活性小分子即为阳性小分子。


图1. Envision多标记微孔板检测仪检测luminescence读数

注意事项

1. 需依据所选用的细胞系生长情况设置384孔板中每孔铺细胞的数量、培养液体积以及培养时长。
2. 使用Multidrop自动分液器铺细胞前，需用10% 84消毒液将分液盒软管消毒，再用灭菌水清洗软管，最后用细胞培养液等渗溶液 (如PBS或细胞培养液) 清洗软管。
3. 若Multidrop自动分液器的分液盒使用年限较长，个别孔道出液量明显大于/小于其他孔道，便会影响384孔板上对应位置的实验结果，在数据分析时需单独分析。
4. 不少活性小分子对细胞具有较强毒性，处理后导致细胞死亡，造成靶蛋白表达下降的假阳性结果。为了排除这一影响，本实验在复筛过程中设置了复板，所有处理与上述实验流程相同，仅在培养48 h后，由加入 ONE-Glo™荧光素酶底物改为加入PrestoBlue™ 细胞活力检测试剂 (Invitrogen, A13261) 进行染色，通过检测其荧光值来判断细胞活性。
   

溶液配方

1. DMEM培养液
   DMEM 94%
   FBS 5%
   Penicillin/Streptomycin 1%
   

致谢

感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台的兰姝珏老师与慈云青老师在实验过程中提供的指导与帮助。

参考文献

1. Gould, S. J. and Subramani, S. (1988). Firefly luciferase as a tool in molecular and cell biology. Anal Biochem 175(1): 5-13.