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本文章节

 

鉴定RNA结合蛋白靶标的CLIP-seq实验方案
CLIP-seq Protocol for Identifying in vivo Targets of RNA Binding Proteins   

陈庚陈庚阮雯阮雯马素平马素平周宇周宇
发表时间:   2022/09/28
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摘要：：在254 nm紫外线照射下，RBP (RNA Binding Protein，RBP) 与其结合的RNA能够发生共价交联，通过免疫共沉淀技术富集目的蛋白及其RNA靶标，并结合强大的高通量测序技术，我们能够精确地鉴定全转录组范围内目的蛋白的RNA结合图谱。因此，CLIP-seq (CrossLinking and ImmunoPrecipitation coupled with high-throughput sequencing，CLIP-seq) 是全面鉴定RNA结合蛋白靶标，解析其生物学功能的强有力技术手段。本方案以RNA解旋酶DDX17为例，探究其在人HeLa细胞系中的RNA结合图谱。

关键词: RBP, 高通量测序, CLIP-seq, DDX17

材料与试剂

  1. 15 cm培养皿
  2. 15 ml离心管
  3. 移液器枪头
  4. DNA/RNA lobind tube 1.5 ml (Eppendorf, catalog number: 022431021)
  5. DNA/RNA lobind tube 2.0 ml (Eppendorf, catalog number: 022431048)
  6. HeLa细胞
  7. RQI RNase-free DNase (Promega, catalog number: M6101)
  8. DDX17 antibody (Proteintech, catalog number: 19910-1-AP)
  9. Normal Rabbit IgG (CST, catalog number: 2729)
  10. RNAsin (Promega, catalog number: N2611)
  11. Micrococcal Nuclease (Thermo Scientific, catalog number: EN0181)
  12. Dynabeads Protein G (Life Technologies, catalog number: 10004D)
  13. FastAP (Life Technologies, catalog number: EF0652)
  14. T4 RNA ligase 2 tr KQ (NEB, catalog number: M0351)
  15. T4 PNK (NEB, catalog number: M0201L)
  16. T4 RNA ligase 1 high concentration (NEB, catalog number: M0437M)
  17. ATP (Invitrogen, catalog number: 18330019)
  18. 32P-γ-ATP (PerkinElmer, catalog number: NEG502A250UC)
  19. NuPAGE 4%~12% Bis-Tris Gel (Invitrogen, catalog number: NP0321BOX)
  20. NuPAGE LDS Sample Buffer (Invitrogen, catalog number: NP0007)
  21. NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20×) (Invitrogen, catalog number: NP0001)
  22. NuPAGE Transfer Buffer (20×) (Invitrogen, catalog number: NP0006)
  23. Proteinase K (Thermo Scientific, catalog number: EO0491)
  24. Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 (Thermo Scientific, catalog number: R1181)
  25. GlycoBlue Coprecipitant (Invitrogen, catalog number: AM9515)
  26. SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, catalog number: 18080044)
  27. Exo-SAP-IT (Affymetrix, catalog number: 78201)
  28. Dynabeads MyOne Silane (Life Technologies, catalog number: 37002D)
  29. RLT buffer (Qiagen, catalog number: 79216)
  30. Phusion High-Fidelity DNA polymerase (Thermo Scientific, catalog number: F530S)
  31. QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, catalog number: 20021)
  32. Oligos (Takara)
    3’ APP-DNA linker：
    rAppp-TGTAGGCACCATCAAT-NH2
    5’ DNA linker：
    5Phos/NNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGT/3spc3
    RT primer：
    TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG
    short xrn1 F primer：
    ACACGACGCTCTTCCGATCT
    short xrn1 R primer：
    TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
    long xrn1 F primer：
    AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    A701R primer：
    CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
    A702R primer：
    CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
  33. SDS (Biosharp, catalog number: BS088)
  34. NP-40 (Amresco, catalog number: M158)
  35. 1M Tris-HCl (pH 7.5) (Invitrogen, catalog number: 15567-027)
  36. MgCl2·6H2O (上海国药, catalog number: 10012818)
  37. EGTA (Millipore, catalog number: 324626)
  38. NaOH (上海国药, catalog number: 10019718)
  39. NaCl (上海国药, catalog number: 10019318)
  40. Na2EDTA (Sigma, catalog number: E5134)
  41. MOPS (Sigma, catalog number: M1254)
  42. Tris (Amresco, catalog number: 0497)
  43. Bicine (Sigma, catalog number: B3876)
  44. Bis-Tris (Sigma, catalog number: B9754)
  45. 甲醇 (上海国药, catalog number: 10014118)
  46. PEG 8000 (US Pharmacopeia, catalog number: 1546605)
  47. 3M醋酸钠 (pH 5.5) (Ambion, catalog number: AM9740)
  48. Glycoblue (Ambion, catalog number: AM9515)
  49. 无水乙醇 (上海国药, catalog number: 10009218)
  50. 异丙醇 (上海国药, catalog number: 80109218)
  51. 氯仿 (上海国药, catalog number: 10006818)
  52. 水饱和酚 (Ambion, catalog number: AM9720)
  53. Washing buffer (见溶液配方)
  54. PNK buffer (见溶液配方)
  55. PNK + EGTA buffer (见溶液配方)
  56. MN buffer (见溶液配方)
  57. PK buffer (见溶液配方)
  58. 20× MOPS buffer (见溶液配方)
  59. 20× Transfer buffer (见溶液配方)
  60. 1× Transfer buffer (见溶液配方)

仪器设备

  1. 移液器
  2. -80 °C冰箱
  3. 普通PCR仪 (Bio-Rad)
  4. 普通离心机及冷冻离心机 (Eppendorf)
  5. 热混仪 (Eppendorf)
  6. 紫外交联仪 (UVP HL-2000 Hybrilinker)
  7. 紫外凝胶成像系统 (Gene Genius)
  8. 电泳仪、转膜槽 (北京六一公司)
  9. 跑胶槽XCell SureLock Mini-Cell (Invitrogen)
  10. 超净工作台 (哈东联公司)
  11. 生物安全柜 (Heal Force)
  12. 细胞培养箱(Thermo scientific)
  13. pH计 (梅特勒-托利delta-320)
  14. 超低温冰箱 (三洋)
  15. 暗盒、X胶片 (富士)
  16. 自动洗片机 (江苏泰星)
  17. 盖革计数器 (model3美国Iudlum公司)

实验步骤

一、UV交联细胞

  1. 首先将HeLa细胞传代至15 cm培养皿中，待细胞生长至80%-90%丰度时开始处理细胞。
  2. 吸弃旧的DMEM培养基，用10 ml预冷的1× PBS漂洗细胞，再加入10 ml预冷的1× PBS，放置合适大小的冰袋于紫外交联仪中，将细胞培养皿平置于冰袋上，选择254 nm紫外灯管 (UV-C)，设置交联能量为400 mJ/cm2。
  3. 交联完成后，用细胞刮刀将细胞刮下，收集到15 ml离心管中，4 °C，100 g离心5 min。
  4. 弃上清，加入1 ml预冷的1× PBS重悬细胞并转移至1.5 ml EP管中，4 °C，10000 g离心1 min。
  5. 弃掉上清，此时可观察到大约150 μl体积的细胞沉淀（约1× 107个细胞），此时可将细胞冻存于-80 °C冰箱中备用或者直接进行下游实验。

二、免疫共沉淀捕获Protein-RNA复合物

  1. 加入1 ml washing buffer重悬裂解细胞，冰置30 min，每隔5 min颠倒混匀一次。
  2. 加入30 μl RQI DNase，混匀，置于热混仪中，37 °C，1,000 rpm，孵育5 min，以充分消解基因组DNA。冰置5 min后，4 °C，15000 g离心20 min。
  3. 吸取上清于新的的EP管中，按下列比例进行分配，并加入相应的抗体，剩余上清可留作Input样品检测IP效率。400 μl IP体系加入4-10 μg antibody (Ab)，Ab用量需根据抗体的IP效价进行调整，需确保Ab能够高效IP相应RBP：
    Ab名称Ab用量(μg)细胞上清(μl)
    DDX175400
    IgG5400
  4. 将EP管置于旋转混合仪上，4 °C旋转孵育2 h。
  5. 各取100 μl ProteinG DynaBeads于两个1.5 ml EP管中，放入磁分离架中，去上清，再加入500 μl冰预冷的washing buffer，用移液器轻柔吹打数次，放入磁分离架中静置，去上清，重复洗涤三次。
  6. 分别用步骤3中的DDX17或IgG孵育液重悬beads，将EP管置于旋转混合仪上，4 °C旋转孵育2 h。
  7. 孵育完成后将EP管置于磁分离架中，吸取并保留IP上清 (IPsup)，可留作Western blotting样品检测IP效率。
  8. 反应结束，依次用下列预冷的缓冲液洗涤beads。洗涤方式：室温条件下使用移液器轻柔吹打数次之后，置于磁分离架上吸弃液体。
    500 μl washing buffer洗涤2次
    500 μl PNK buffer洗涤2次

三、RNA片段化

  1. 用1× MN buffer稀释MNase (Micrococcal Nuclease, MNase) 成1:1000 (1:1K, 高浓度) 和1:1000,000 (1:1M, 低浓度) (需要通过预实验摸索合适的低浓度MNase稀释比例来片段化RNA)。
  2. 将上述洗涤后的Beads分别按照8:1:1比例分装于新的EP管中，编号为L，S1，S2，置于磁分离架弃上清后，按下表所示加入相应的MNase消解RNA：
    Beads编号MNase浓度MNase体积 (μl)
    Beads编号MNase浓度MNase体积 (μl)
    L1:1M480
    S11:1M60
    S21:1K60
  3. 将上述EP管置于热混仪中，37 °C，1,000 rpm消解10 min。
  4. 反应结束，依次用下列预冷的缓冲液洗涤beads。
    500 μl PNK+EGTA buffer 2次
    500 μl washing buffer 2次
    500 μl PNK buffer 2次
  5. 将S1和S2 beads置于磁分离架上去上清，于-20 °C冻存。L beads去上清后继续下游步骤。

四、去除3’末端磷酸基团

  1. 准备去除3’末端磷酸基团的反应体系。
    10× fastAP buffer6 μl
    DEPC H2O51 μl
    FastAP3 μl
    Total60 μl
  2. 各用上述反应体系60 μl重悬L beads，置于热混仪中，37 °C，1,000 rpm，15 s/3 min，孵育10 min。
  3. 反应结束，依次用下列预冷的缓冲液洗涤beads，洗涤方式同步骤二（8）。
    500 μl PNK+EGTA buffer 洗涤2次
    500μl PNK buffer 洗涤2次

五、连接3’ App-DNA linker

  1. 准备linker buffer
    3’ App-DNA linker (20 μM)12 μl
    DEPC H2O18 μl
    Total30 μl
  2. 各用上述linker buffer 30ul重悬beads，冰置。
  3. 准备连接反应体系
    10× T4 RNA ligase buffer6 μl
    50% PEG 800012 μl
    DEPC H2O9 μl
    T4 Rnl2tr KQ3 μl
    Total30 μl
  4. 各将上述连接反应体系30 μl加入到linker buffer重悬的beads中，置于热混仪中，1,000 rpm，15 s/4 min，25 °C反应2 h或者16 °C反应过夜。
  5. 用下列预冷的缓冲液洗涤磁珠，洗涤方式同步骤二（8）。
    500μl PNK buffer 洗涤3次

六、32P标记RNA 5’端

  1. 准备标记反应体系
    10× PNK buffer6 μl
    32P-γ-ATP2 μl
    DEPC H2O49 μl
    T4 PNK3 μl
    Total60 μl
  2. 各用上述60 μl标记反应体系重悬L beads，20 μl重悬S1和S2 beads。并置于热混仪中，37 °C，1,000 rpm，15 s/4 min，孵育10 min。
  3. 各管补加1 μl ATP (10 mM)，同样条件继续孵育10 min。
  4. 反应结束，用下列预冷的缓冲液洗涤磁珠，洗涤方式同步骤二（8）。
    500μl PNK+EGTA buffer 3次。

七、胶分离RNA-Protein复合物及转膜

  1. 准备工作浓度的NuPAGE LDS buffer，L beads加入60 μl，S1和S2 beads各加入20 μl，重悬beads，同时将留存的10% Input和10% IP上清，一并置入热混仪中，70 °C，1,000 rpm，15 s/4 min，孵育10 min。
  2. 孵育完成，瞬间快速离心，将上清转移至新的EP管中，冰置，准备上样。
  3. 选用4%~12%的梯度NuPAGE Gel，配制400 ml 1× MOPS Running Buffer，冰置预冷。
  4. 将IP样品全部上样，每孔上样20 μl，L beads样品可上样到三个孔，冰浴条件下跑胶。调节电压80V~120V，电泳约2 h，待NuPAGE LDS BF中的溴酚蓝条带跑至底部时停止电泳 (因为其中含有未反应完的32P-γ-ATP，因此尽量不要使溴酚蓝跑出凝胶，方便放射性废物的处理)。
  5. 按下列配方配制1× Transfer Buffer，采用湿转装置将凝胶中的RNA-蛋白复合物转印到NC膜上。恒流250 mA，100 min (可根据转膜后凝胶上残留的放射信号和透过NC膜转印到滤纸上的放射信号来优化最佳的转膜时长。此处NC膜比PVDF膜效果更佳，需要注意NC膜不能使用甲醇浸泡激活)。
    20× Trans Buffer25 ml
    10% SDS 500 μl
    甲醇50 ml
    DEPC H2O425 ml
    Total500 ml
  6. 转膜完成后，将NC膜包裹在一层干净的保鲜膜中，放入暗夹中，在-80 °C冰箱中过夜显影 (一次可叠加3~4张X光片同时曝光，以便选取合适信号强度的结果，如果信号偏弱，可选用增感屏以增强信号强度)。

八、抽提目的蛋白结合的RNA

  1. 对照1:1K高浓度MNase消解样品的同位素信号，在DDX17 L beads样品 (三条lane)同样大小位置处，切取上方5~15 KDa范围内的NC膜，并将NC膜剪成小块放入新的EP管中。切取IgG样品同样大小位置的NC膜作为对照。
  2. 剩余的NC膜 (Input，IPsup，S1、S2 beads样品的lane) 继续孵育DDX17抗体，完成Western Blotting后续流程，以检测IP效率。
  3. 配制蛋白酶K工作液，置于热混仪中，37 °C，1,000 rpm，孵育20 min，以降解可能存在的核酸酶。
    蛋白酶K (19.6 mg/ml)200 μl
    1× PK buffer800 μl
    Total1ml
  4. 各取上述酶工作液200ul加入到放有NC膜的EP管中，将EP管置于热混仪中，37 °C，1,000 rpm，孵育20 min，以降解RNA-蛋白复合物中的蛋白质，将RNA释放到反应体系中。
  5. 配制PK+SDS buffer，各取200 μl加入到上述反应体系中，50 °C，1,000 rpm，孵育20 min，确保蛋白消解充分。
    20% SDS10 μl
    1× PK buffer990 μl
    Total1ml
  6. 向EP管中加入400 μl水饱和酚和130 μl氯仿，上下颠倒混匀，置于热混仪中，继续37 °C，1,000 rpm，孵育20 min。
  7. 将EP管放入4 °C离心机中，15000 g，离心20 min。
  8. 小心吸取溶有RNA的上层水相，转移至新的EP管中，加入50 μl醋酸钠 (3 M，pH 5.2)，1 μl Glycoblue，500 μl无水乙醇和500 μl异丙醇，上下颠倒充分混匀，放入小铅罐中，并置于-80 °C冰箱中沉淀过夜。
  9. 取出样品，放入4 °C离心机中，18000 g，离心20 min。
  10. RNA沉淀非常少，肉眼几乎不可见，小心吸弃上清，缓慢加入1 ml预冷的75%乙醇，轻微颠倒EP管数次洗涤RNA沉淀，避免打散沉淀，造成RNA损失。
  11. 放入4 °C离心机中，18000 g，离心20 min。
  12. 小心吸弃上清后，瞬间高速离心，用10 μl小枪头吸尽残留液体，室温干燥5 min。

九、SuperScript III逆转录

  1. 准备RT primer，每管加入10 μl回溶RNA，转移至新的PCR管中。
    RT primer (10 μM)1 μl
    DEPC H2O9 μl
    Total10 μl
  2. 将PCR管放入PCR仪中，65 °C 5 min，立即冰置。
  3. 配制RT体系。
    5× RT buffer4 μl
    dNTPs (10 mM)1 μl
    DTT (100 mM)1 μl
    RNAsin1 μl
    DEPC H2O2 μl
    Superscript III1 μl
    Total10 μl
  4. 将上述10 μl的RT体系加入到溶解的10 μl RNA中，置于PCR仪内。设置程序：
    50 °C，30 min；
    55 °C，30 min；
    90 °C，5 min。即获得cDNA文库。

十、去dNTPs，RT primer及RNA

  1. ExoSAP消解dNTPs和RT primer。RT产物中加入8 μl ExoSAP，置于PCR仪中37 °C消解15 min。消解完成后加入1 μl 0.5 M EDTA终止反应。
  2. 碱水解RNA。加入2.5 μl 1 M NaOH于上述反应体系中，在PCR仪中75 °C消解10 min，再加入2.5 μl 1M HCl中和体系的pH。

十一、Silane回收cDNA

  1. 将上述反应产物转移至1.5 ml EP管中。
  2. 取10 μl MyONE silane beads，加入300 μl RLT buffer吹打数次，置于磁分离架上，吸弃上清，重复洗涤两次。
  3. 吸取119 μl RLT buffer重悬MyONE silane beads，将其加入到cDNA反应产物中，吹打混匀，加入153 μl无水乙醇，混匀，室温孵育10 min。
  4. 将样品置于磁分离架上，吸弃上清，加入600 μl 75%乙醇吹打数次后，置于磁分离架上，弃上清。重复洗涤两次。
  5. 瞬间高速离心，吸净液体，室温晾干5 min。

十二、连接5’ DNA linker

  1. 准备5’ DNA linker，取10 μl重悬beads，置于热混仪中，65 °C 5 min，马上冰置。
    5’ DNA linker (200 μM)1 μl
    DEPC H2O9 μl
    Total10 μl
  2. 配制连接反应体系。
    10× T4 RNA ligase buffer3 μlATP (10 mM)3 μl50% PEG 80006 μlDEPC H2O5 μlRNA ligase high conc3 μlTotal20 μl
  3. 吸取20 μl上述连接反应体系，加入到linker重悬的beads中，混匀，置于热混仪中，1,000 rpm，15 s/4 min，25 °C反应2 h或者16 °C反应过夜。

十三、Silane回收linker-ligated cDNA

  1.  吸取5 μl MyONE silane beads，加入300 μl RLT buffer吹打数次，置于磁分离架上，吸弃上清，重复洗涤两次。
  2. 吸取105 μl RLT buffer重悬MyONE silane beads，将其加入到cDNA连接反应产物中，吹打混匀，加入135 μl无水乙醇，混匀，室温孵育10 min。
  3. 将样品置于磁分离架上，吸弃上清，加入600 μl 75%乙醇吹打数次后，置于磁分离架上，弃上清。重复洗涤两次。
  4. 瞬间高速离心，吸尽液体，室温晾干5 min。
  5. 吸取25 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)，重悬beads，室温放置10 min，使linker-ligated cDNA充分洗脱下来，将样品放入磁分离架上，吸取上清转移到新的EP管中。此即为cDNA文库。

十四、Phusion第一轮PCR扩增

  1. 配制如下PCR反应体系。
    5× GC buffer10 μl
    dNTPs (10 mM each)1 μl
    Short xrn1 F primer (10 μM)2 μl
    Short xrn1 R primer (10 μM)2 μl
    DMSO1.5 μl
    DEPC H2O28 μl
    Phusion DNA polymerase0.5 μl
    cDNA template5 μl
    Total50 μl
  2. 设置PCR循环程序如下：
    Step 1 98 °C，30 s；
    Step 2 98 °C，10 s；
    Step 3 54 °C，30 s；
    Step 4 72 °C，15 s；
    Go to Step 2 for 15 cycles；
    Step 5 72 °C，1 min。

十五、胶回收PCR产物

使用QIAEX II Gel Extraction Kit回收PCR产物，跑4%琼脂糖凝胶，回收85~125 bp范围内的PCR产物，回收产物溶解于20 μl TE buffer中。


十六、Phusion第二轮Barcode PCR产物

  1. 以第一轮胶回收的PCR产物做模板，进行第二轮PCR，通过反向引物引入八个碱基的barcode，从而便于多个样本混到一起进行高通量测序时，区分不同的样本数据。
  2. 配制如下PCR反应体系。
    5× GC buffer10 μl
    dNTPs (10 mM each)1 μl
    Long xrn1 F primer (10 μM)2 μl
    A701R/A702R primer (10 μM)2 μl
    DMSO1.5 μl
    DEPC H2O28 μl
    Phusion DNA polymerase0.5 μl
    Template5 μl
    Total50 μl
  3. 设置PCR循环程序如下：
    Step 1 98 °C，30 s；
    Step 2 98 °C，10 s；
    Step 3 58 °C，30 s；
    Step 4 72 °C，15 s；
    Go to Step 2 for 5 cycles；
    Step 5 72 °C，1 min。
    （为避免产生过多PCR扩增产物，导致文库复杂度降低，第一轮PCR循环数的范围为15-20，第二轮PCR循环数范围为5-10。）

十七、胶回收第二轮PCR产物
使用QIAEX II Gel Extraction Kit回收PCR产物，跑4%琼脂糖凝胶，回收165~205 bp范围内的PCR产物，回收产物溶解于20 μl TE buffer中。此即为最终得到的CLIP-seq文库。(可选步骤：取1 μl文库作为模板，使用可加A的PCR酶进行扩增，回收PCR产物进行TA克隆，选取阳性克隆进行一代测序，以检查两端接头序列是否完整无误，抓到的靶序列比对到基因组上的信息等。若大部分序列可以比对到基因组上，则证明得到了较高质量的文库，可进行下一步的高通量测序)

十八、高通量测序与分析流程
测序平台及参数：Illumina Hiseq2500平台的SE50模式和HiseqX10平台的PE150模式均适用，目标数据量30 million reads。可综合考虑测序周期、价格、质量等因素选择合适的平台以及测序深度。
       分析流程简述：以Hiseq2500平台的SE50模式为例，下机数据使用去接头软件，如cutadapt、trimmomatic等，去除3’接头序列。剩余序列再去掉5’末端的PCR barcode（通过5’ DNA linker引入的6个随机碱基N），保留长度大于18 nt的reads，即为clean reads。接下来用Bowtie比对软件以线粒体RNA、rRNA和tRNA作为参考序列去比对clean reads，未比对上的reads进一步以人类基因组（hg38）为参考序列去比对，可保留唯一比对的reads，进而通过call peak软件如CLIPper（https://github.com/YeoLab/clipper/），对比对上的reads进行分析，鉴定可靠的蛋白结合位点peaks及靶标RNAs。进一步可对peaks进行基序（motif）分析，如使用Homer （http://homer.ucsd.edu/homer/motif/）等软件，鉴定结合位点中富集的motifs，可作为目的RNA结合蛋白的特异性RNA基序。

结果与分析

图1展示的是不同浓度稀释梯度的Micrococcal Nuclease酶切DDX17 IP产物的结果。其中左图放射自显影结果显示：与高浓度MNase (1:1K) 处理样品相比，低浓度MNase (1:1M) 处理样品具有明显往上偏移的条带。结合右图Western blotting DDX17的条带，可以确定DDX7-RNA复合物的位置，切割回收DDX17结合的RNA并继续下游的建库测序流程。需要注意的是，如果低浓度MNase (1:1M) 处理样品相比于高浓度MNase (1:1K) 处理样品，没有明显往上偏移的条带，则说明实验没有成功，建议筛查原因并得到理想的结果后，再进行下游的建库流程。


图1. 放射自显影检测不同MNase浓度消解的DDX17-RNA复合物

失败经验

CLIP-seq实验RNA建库起始量极少，同时步骤繁多，影响RNA“质”和“量”的因素都会对实验结果造成累加影响，这是此类实验的主要难点。耐心细致的实验前准备，娴熟扎实的实验基本功都有助于得到高质量的文库。例如：通过挑选IP效率高的抗体和优化各环节实验条件、材料等以提高RNA的质量和降低建库过程的损失。

溶液配方

  1. Washing buffer
    组分                 重量/体积
    10× PBS          40 ml
    SDS                 0.4 g
    NP-40             2 ml
    超纯水            to 400 ml
    调节pH到7.4，用0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用
  2. PNK buffer
    组分                                                      重量/体积
    100 mM Tris-Cl (pH 7.4)                    100 ml
    MgCl2·6H2O                                        0.81 g
    NP-40                                                  2 ml
    超纯水                                                  to 400 ml
    调节pH到7.4，用0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用
  3. PNK + EGTA buffer
    组分                                                    重量/体积
    100 mM Tris-HCl (pH 7.4)               100 ml
    EGTA                                                  1.52 g
    NP-40                                                 2 ml
    超纯水                                                to 400 ml
    调节pH到7.4，用0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用
  4. MN buffer
    组分                                                   重量/体积
    1 M sodium glycine (pH8.6)          1 ml
    0.1 M CaCl2                                      1 ml
    超纯水                                               to 10 ml
    用0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用。
  5. PK buffer
    组分                                                 重量/体积
    1 M Tris-HCl (pH 7.4)                    4 ml
    NaCl                                                0.12 g
    Na2EDTA                                         1.52 g
    NP-40                                              2 ml
    超纯水                                            to 40 ml
    用0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用
  6. 20× MOPS buffer
    组分                                               重量/体积
    MOPS                                           52.3 g
    Tris                                                30.3 g
    SDS                                                5.0 g
    Na2EDTA                                       1.9 g
    超纯水                                           to 250 ml
    4 °C储存，使用时稀释成1×，现配现用
  7. 20× Transfer buffer
    组分                                              重量/体积
    Bicine                                           10.2 g
    Bis-Tris                                         13.1 g
    Na2EDTA                                      0.95 g
    超纯水                                          to 125 ml
    4 °C储存
  8. 1× Transfer buffer
    组分                                              重量/体积
    20× Transfer buffer                   25 ml
    10% SDS                                      500 μl
    甲醇                                              50 ml
    超纯水                                          to 500 ml
    现配现用，冰预冷

致谢

该工作得到国家自然科学基金 (31922039) 的资助。该实验方案改编自本实验的发表文章Shao等 (2014) 和Jiang等 (2017)，以及Nostrand等 (2016)。

参考文献

  1. Jiang, L., Shao, C. W., Wu, Q. J., Chen, G., Zhou, J., Yang, B., Li, H.R., Gou, L. T., Zhang, Y., Wang, Y. M., Yeo, G. W., Zhou, Y. and Fu, X. D. (2017). NEAT1 scaffolds RNA-binding proteins and the Microprocessor to globally enhance pri-miRNA processing. Nat Struc Mol Biol 24(10): 816-824.
  2. Nostrand, E.V., Pratt, G.A., Shishkin, A.A., Burkhart, C.G., Fang, M.Y., Sundararaman, B., Blue, S.M., Nguyen, T.B., Surka, C., Elkins, K., Stanton, R., Rigo, F., Guttman, M. and Yeo, G.W. (2016). Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods 13(6): 508-514.
  3. Shao, C. W., Yang, B., Wu, T. B., Huang, J., Tang, P., Zhou, Y., Zhou, J., Qiu, J. S., Jiang, L., Li, H. R., Chen, G., Sun, H., Zhang, Y., Denise, A., Zhang, D. E. and Fu, X. D. (2014). Mechanisms for U2AF to define 3’ splice sites and regulate alternative splicing in the human genome. Nat Struc Mol Biol 21(11): 997-1005.
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Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：陈庚, 阮雯, 马素平, 周宇. (2022). 鉴定RNA结合蛋白靶标的CLIP-seq实验方案. Bio-101: e1010814. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010814.

提问与回复

如果您对本实验方案有任何疑问/意见, 强烈建议您发布在此处。我们将邀请本文作者以及部分用户回答您的问题/意见。为了作者与用户间沟通流畅（作者能准确理解您所遇到的问题并给与正确的建议），我们鼓励用户用图片的形式来说明遇到的问题。

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